医学细胞生物学教材教学课件.ppt

问题一 下面的图片是在哪种显微镜下观察到的结果;问题三：如果想知道某一中蛋白质在细胞中的分布和不同组织中表达量的差异，如何设计实验？;第二章 细胞生物学的研究方法;第三节 细胞的分离和细胞组分的分离;一 细胞的分离;一 细胞的分离;*;*;*;*;;*;*;T淋巴细胞;*;*;*;*;*;*;;从血液、体液中分离细胞;制备细胞匀浆;二 细胞器及细胞组分的分级分离;密度梯度离心;2 速度沉降（velocity sedimentation） 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器 原理：制备梯度离心介质（密度由顶部到底部逐渐增加）,分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降，形成不同的沉降带而达到分离。 梯度特点:梯度平缓，密度较低( 5%-20%)，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 分离效率: 取决于沉降系数间的差异。 ;速度沉降;3 平衡沉降（equilibrium sedimentation） 用途：分离大小、形态相似而密度不同的组分。 特点： （1）介质密度较高，陡度大(20%-70%） ，介质的最低密度应大于被分离组分的最大密度。 （2）所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。 分离效率: 取决于浮力密度间的差异;速度沉降;速度沉降：大小和形状;CsCl平衡沉降证实DNA半保留复制（1957， Meselson，Stahl ）;三 蛋白质的分离与鉴定;;离子交换层析：是一种根据被分离物质的分子表面电荷性质来分离的吸附层析。;将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 ;; SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapir0建立，其原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N’??N’ 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。;等电聚焦电泳(IFE）利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。 ;等电聚焦电泳进行过程中;C 双向电泳 第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异，垂直方向反映出它们在分子量上的差别。;四 核酸的分离纯化与鉴定;细胞化学技术（Cytochemistry）：在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研究细胞和细胞内的细胞器的结构、功能关系的一种技术。;第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术;一、酶细胞化学技术 通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。;二、免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry） 利用抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性的特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法。;常用的标记方法： 1)荧光标记：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明 2)酶标记：辣根过氧化物酶（HRP） 3)铁蛋白标记：铁蛋白是含铁离子的蛋白质，在电镜 下铁离子可显黑色 4)胶体金标记：即金的水溶液，具有一般溶液的特 性，用它与抗体标记后，经抗原抗体 反应可定位抗原的存在。;免疫铁蛋白电镜技术;免疫胶体金电镜技术; 免疫荧光显微镜技术 （Immunofluorescence microscopy）;荧光素标记抗体的方法： 直接法：荧光素直接和第一抗体相偶联 优点：简单方便，易于操作，省时省力 缺点：敏感度不够，特异性不强，标记抗体需自己制备 间接法：荧光素先和第二抗体（抗第一抗体的抗体）偶联，再 与第一抗体作用 优点：敏感度高，特异性强，可购买不同的标记二抗 缺点：操作比直接法复杂;;三、放射自显影术(autoradiography) 放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感光材料感光。利用这样的特性，用放射性化合物脉冲标记活细胞,经固定、切片后在暗处把感光乳胶覆盖于切片上,在此期间,由于放射性同位素衰变使乳胶曝光(卤化银还原成银离子),