第四章沉淀法 - 2015年最新《生物物质分离与纯化技术》ppt课件.ppt

生物分离过程的一般流程 通过本章学习应掌握以下内容 什么是沉淀法？ 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？ 常用的沉淀方法包括哪些？ 何谓盐析？其原理是什么？ 常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 等电点沉析的工作原理是什么？ 沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步 纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 沉淀法的原理： 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的， 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。 概 述 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行： 概 述 沉淀法操作步骤 ： ①首先加入沉淀剂， ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。 沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 沉淀法的分类 根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8） 选择性沉淀法。 4.1 蛋白质的溶解特性 蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。 因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。 蛋白质的溶解特性 蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 ⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 ⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。 盐析 概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的 早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。 　 盐析法机理 （1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。 1）盐析用盐的选择 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的