[理学]人类人工染色体的构建策略_百替生物.pdfVIP

人类人工染色体的构建策略 摘要： 目前各种应用于基因治疗领域的载体均存在一定的局限性。越来越多的研究者认为，最理想的基因治疗载体应该在染色体的结构基础上构建，使 目的基因整合后能够作为独立的功能单位表达，或者成为游离基因而稳定存在。人类人工染色体（humanartificialchromosome,HAC）的出现，使这种 设想成为可能。近年来，研究者们基于两种基本策略相继构建多种HAC，并以之作为载体进行了一系列外源性基因表达研究，尽管还有许多问题亟待解 决，但并不妨碍人们对之成为理想的基因治疗载体寄予厚望。 关键词： 人类人工染色体； 载体； 基因治疗 中图分类号： R394 理论上讲，理想的基因治疗载体应该完全由天然染色体成分组成，至少具备三个结构要素：复制原点、端粒和着丝粒。当其进入靶细胞后，目的基因能 够模拟自然条件下基因表达或者作为游离基因而稳定复制，即可控性表达，这是基因治疗成功的关键所在。外源性基因进入靶细胞后，若其表达处于失 控状态，将带来严重的后果。最理想的可控性模式是模拟人类基因自然状态下的调控形式，实现这种可控性表达需要目的基因全长或包括上下游的调控 区及内含子，这就对载体系统提出了极高的要求，它必须具备数十个kb到几百个kb的包装能力，同时还要考虑到重复序列的DNA 重排和丢失问题； 其次，一个如此长的片段进入细胞内，其整合位点相当重要，最终理想是能够实现定点插入，或者作为一个游离基因表达。传统的基因治疗载体，如逆 转录病毒载体、腺病毒载体等，很难达到以上要求，并且存在免疫异源性、插入诱变等许多问题。 1． HAC 的构建策略 人工染色体的构想，为载体研究提供了新的思路。这类载体不需要病毒蛋白质衣壳；能够象天然染色体一样以线状或环状存在；同时，在缺乏选择压力 的情况下，能够以较低的拷贝数在细胞内稳定存在；有无限的克隆能力；不但能插入靶基因，还能插入其他的调控元件或特异性细胞靶向元件。基于上 述优点，研究者们对其倾注了不懈的努力。1983年，酵母人工染色体构建成功，14年后，第一个HAC的成功构建，被认为是基因治疗载体研究领域的 重大突破。此后，研究者相继构建了各种不同的HAC。目前，构建HAC 基于如下两种策略。 （1） 自上而下的策略 该策略是以天然染色体的断裂片段为基础，构建新的HAC。这些断裂片段主要通过以下方法得到：（a）低剂量辐射;（b）端粒 定位染色体截断技术（见图1）;（c）外源性DNA 片段定点插入后扩增;（d）天然染色体有丝分裂过程中自发产生的碎片。研究者发现，将外源性端粒 DNA整合入哺乳动物染色体，可将该染色体截断，同时在断端产生新的端粒。研究者们应用这种技术修剪哺乳动物染色体，成功构建了一系列大小在0.5～ 6 Mb之间不等HAC。最初，端粒DNA 整合的位点是随机的，而现在，研究者们能够将端粒DNA定点插入染色体中特定的位点。所获得的这些微型染 色体在结构上相当稳定。Grimes等[1,2]将外源性DNA 插入小鼠和人类染色体着丝粒区，扩增这些DNA导致染色体裂解为60～400 Mb 大小的片段，然 后纯化这些片段用于显微注射或者脂质体介导的转染以构建HAC。另外，研究者还利用自然条件下人类染色体有丝分裂产生的碎片（hCF），通过微细 胞介导染色体转移技术，构建人类微型染色体载体。以上的微型人工染色体中，有相当一部分被证实对小鼠生殖细胞系细胞有高效的转染能力，同时， 这些线状HAC的大小和结构已基本清楚，有望作为载体应用于基因治疗。 （2） 自下而上的策略 该策略是在细胞内或者细胞外将着丝粒DNA、端粒DNA 以及复制原点装配在一起，从而构建HAC。研究者应用这种策略，在 HT1080细胞中得到了第一种HAC。他们将1 Mb的人17号染色体的α卫星DNA、人端粒DNA、人基因组DNA 随机片段用脂质体共转染HT1080细 service@100 service@100 wwwwww..110000bbiiootteecchh..ccoomm sseerrvviiccee@@110000bbiiootteecchh..ccoomm 胞。经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按 照正常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而丢失、降解。由此通过有丝分裂而自然筛选出H