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米根霉整合表达载体构建及其遗传改造 报告人：张旻 导师：姜绍通教授 背景及研究进展 米根霉Rhizopus oryzae是一种重要的工业微生物，是生产高纯度L-乳酸的理想菌种之一。同其他许多丝状真菌一样，由于其培养条件简单，具有高效的分泌表达系统以及易于实现大规模连续发酵等优点，也有着应用于同源或者异源蛋白表达，成为一种高效基因工程菌的潜力。加之米根霉全基因组测序工作已经完成并已在互联网中进行了公布（/annotation/genome/rhizopus_ory zae/MultiHome.html），许多有待研究的未知功能的基因之序列及在基因组中所处位置也已为世人所知晓，对米根霉进行研究以及应用的空间又拓展到了一个新的层次。这也为米根霉基因改造工作提供了重要的前提条件。 对于丝状真菌重组表达系统的研究工作主要是集中在子囊菌纲的曲霉菌属以及木霉菌属，以及少数几种毛霉目真菌当中。其中以粗糙脉孢霉及构巢曲霉最早建立其转化体系，分别为1983年和1979年，到目前为止已有近百种丝状真菌已经建立了DNA转化系统。但是对于米根霉基因功能及其异源蛋白表达系统的有关研究工作及资料仍然较少。相应的对于米根霉转化系统的建立的报道也是十分有限，且只适用于非常特殊的米根霉菌株，而非广泛适用。 目前对于微生物菌株改造一般有两种策略：一、改造已有发酵能力的菌种，将其与底物利用相关的基因进行改造，增强其底物利用能力；二、选取不具备此种发酵能力，但是易于进行基因工程改造，或已经广泛应用为各种外源基因宿主，同时具备高蛋白表达量的菌株（常用的如大肠杆菌及各种酵母菌等等），导入关键酶基因。 大多数丝状真菌以PEG/CaCl2介导原生质体转化、电转化以及基因枪转化为主要的转化手段，营养缺陷标记与抗生素抗性标记作为筛选标记。目前脲嘧啶缺陷作为筛选标记应用比较广泛，相对的，对于宿主菌的要求也比较高（一般需自己诱变选育对应营养缺陷型菌株或者与菌株拥有者交流索取）。以抗生素抗性（如新霉素、杀稻瘟素S、其他部分乙酰胺类抗生素，以及逐渐广泛应用于丝状真菌遗传转化的潮霉素等等的抗性）为选择标记在近年来发展较为迅速，随着多种抗生素抗性基因的分离及功能分析鉴定的完成，其作为一种方便并适用范围广的筛选方法被用于越来越多的丝状真菌转化研究当中。 大多数丝状真菌采用整合型转化，通过单交换以同源或随机插入重组的方式整合到基因组中。尤其是对于米根霉，由于目前尚没有能在米根霉菌体内以稳定的形式自主复制的质粒，因此构建整合型质粒仍为第一选择。 目前所需要做的工作 针对米根霉设计一种能够适应于现有的野生型米根霉的基因转化及筛选体系，和对应的载体； 应用这种体系对米根霉中特定的目标蛋白的编码基因进行改造（如木糖代谢相关酶），从而使米根霉的发酵性能得到强化。 整体研究思路 木糖代谢限速步骤关键酶分析 以木糖为发酵底物比较XR与XDH活力； 以木糖和木糖醇分别作为底物进行发酵，比较底物利用速率、菌体生长量以及乳酸产量； 关键酶的编码基因序列。 以木糖为发酵底物比较XR与XDH活力 以木糖和木糖醇分别作为底物进行发酵，比较底物利用速率、菌体生长量以及乳酸产量 关键酶的编码基因序列 从Broad Institute of Harvard and MIT的米根霉基因组数据库Rhizopus oryzae Database (/annotation/genome/rhizopus_ oryzae/MultiHome.html)中以Pichia stipitis、Neurospora crassa、Aspergillus niger等的XR蛋白氨基酸序列及其对应编码基因序列为线索进行同源搜索，搜寻到米根霉基因组中含有的6条可能的米根霉XR编码基因序列（氨基酸序列同源率最低达到38%以上），将这6条序列在NCBI中再次进行比对分析，最终得到可能性最高的一条隶属于aldo/keto reductase家族蛋白的编码基因Locus RO3G_11716.3，而此基因编码的蛋白也与Aspergillus clavatus NRRL1 的D-xylose reductase (Xyl1)蛋白的氨基酸序列最为相近，都含有多个共同的保守序列，这些序列所在位置可能存在此种蛋白的一些潜在活性中心位点。 同样，也获得了XDH及XK的可能的编码基因Locus RO3G_16589.3以及Locus RO3G_02257.3，这两条基因在NCBI不同微生物中相对应的酶类编码基因有着一定的同源性。 目标DNA双链合成 扩增的片段经过回收后连入准备好的克隆/测序载体中转化感受态大肠杆菌进行克隆并用于测序分析。 测序结果与米根霉基因组数