胆固醇氧化酶.PPT

第二十六章 酶促反应法测定生物化学物质 * 第三节 过氧化物酶指示系统测定法 过氧化物酶指示系统是临床生化物质最常用的测定方法之一。体内许多生化物质可以直接或间接地在氧化酶的催化下，生成H2O2，因此可用Trinder反应指示终点。这类方法的优点是可以在可见光范围内比色，易于自动化，因此具有比较重要的临床价值。 一、葡萄糖 （一）测定方法概述 1、氧化还原法（无机化学法） 2、缩合法（有机化学法）：邻甲苯胺法 3、酶法：葡萄糖氧化酶（GOD-POD）法、 己糖激酶（HK）法 葡萄糖脱氢酶法 葡萄糖氧化酶-氧速率（GOD-POR） 葡萄糖 ＋ O2 G-6-P ＋ ADP HK G-6-P ＋ NADP 6-GP ＋ NADPH ＋H G-6-PD ＋ ＋ (二）葡萄糖氧化酶法 1、原理： 葡萄糖 ＋ O2 葡萄糖酸 ＋ H2O2 GOD H2O2＋4-AAP＋酚 醌亚胺＋4H2O POD 2、性能评价 GOD仅高特异的催化β-D-葡萄糖，而葡萄糖中α型约占36%，因此葡萄糖的完全氧化需要α型变旋为β型。现在的试剂大多含有变旋酶，可促使α型向β型的转变，延长孵育时间也可以达到自发变旋。 葡萄糖的测定结果受饮食的影响。 二、糖化血清蛋白 （一）测定方法概述 血清清蛋白在高血糖情况下会发生糖基化，主要是清蛋白肽链189位的赖氨酸与葡萄糖结合形成的高分子酮胺结构，该结构类似于果糖胺，因此糖化血清蛋白（GSP）的测定也称为果糖胺测定。 GSP的常用测定方法有硝基四氮唑蓝（NBT）化学比色法和酮胺氧化酶（KAO）法。NBT法基于酮胺结构可以在碱性环境中与NBT反应生成蓝紫色的化合物。 与NBT法相比，KAO法的精密度和准确度更高。 （二）酮胺氧化酶法 1、测定原理： 糖化血清蛋白 糖化蛋白片段 蛋白酶K 糖化蛋白片段 氨基酸 ＋ 葡萄糖 ＋ H2O2 酮胺氧化酶 色原 ＋ H2O2 显色物 ＋ H2O POD 2、方法性能评价 KAO法稳定，特异性强，具有酶法的基本优点。 样本在4℃可保存3周，－20 ℃保存5周。 当病人血浆蛋白低于35g/L时，GSP偏低。 三、血清甘油三酯 （一）测定方法概述 TG测定方法有：物理化学法（同位素稀释-质谱法） 化学法（氯甲烷抽提变色酸显色法、 正庚烷-异丙醇抽提乙酰丙酮显色法） 酶法（甘油磷酸脱氢酶法、甘油磷酸脱氢 酶偶联NBT的比色法、甘油磷酸氧 化酶偶联Trinder反应法） 甘油磷酸脱氢酶法 TG 甘油＋脂肪酸 LPL 甘油＋NAD 二羟丙酮＋NADH＋H GDH ＋ ＋ （二）甘油磷酸氧化酶法 1、测定原理 TG ＋ 3H2O 甘油 ＋ 脂肪酸 LPL 甘油＋ATP 3-磷酸甘油＋ADP GK 3-磷酸甘油 ＋O2 ＋ 2H2O 磷酸二羟丙酮＋2H2O2 GPO H2O2＋4-AAP＋4-氯酚 醌亚胺＋2H2O＋HCL POD 2、性能评价 该法通常称为GPO-PAP法，结果比GDH法约低3%。该法可采用血清或血浆标本，若采用血浆，应将结果乘以标准系数1.03，并在报告单注明。由于乳糜微粒含有大量的TG，可影响检验结果，因此需要空腹12h以上采血。与GDH法相比，该方法易受到还原性物质的干扰，但是由于方法稳定，测定简单，是目前主要采用的检测方法。 四、血清总胆固醇 （一）测定方法概述 ①同位素稀释-质谱法：是决定性的方法。 ②化学法：采用有机溶剂提取血清中TC，用特殊试剂 显色，主要显色反应有L-B反应及高铁-硫 酸反应两类，然后比色测定。 ③酶法：胆固醇氧化酶（COD-PAP） （二）胆固醇氧化酶法 1、测定原理 胆固醇酯＋H2O 游离胆固醇＋游离脂肪酸 CEH 胆固醇＋O2 △ -胆甾烯酮＋H2O2 COD 4 H2O2＋4-AAP＋4-氯酚 醌亚胺＋4H2O POD 2、方法性能评价 COD-PAP法标本用量小，结果可