细胞系与细胞克隆(PPT-28).pptVIP

;教学目的：; 细胞系cell line：原代培养物经首次传代后即成。 有限细胞系finite cell line: 不能继续传代或传代数有限。 连续细胞系continuous cell line：可连续传代的细胞系，即已建成的细胞系。 细胞株cell strain：通过选择法和克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养物。;一、传代培养（passage）;（一）传代培养的方法 1、从生长器皿上解离细胞的方法： 1）震荡法。 2）胰蛋白酶消化法 3）胰蛋白酶-柠檬酸盐 4）用EDTA洗细胞再用胰蛋白酶-柠檬酸盐处理 5） EDTA洗再用胰蛋白酶-EDTA消化 6） EDTA洗再用胰蛋白酶-胶原酶配合柠檬酸盐或 EDTA消化 7）机械刮削法（scraping） 8）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1-1.0 1mg/ml) ; 2.单层培养细胞的一般传代步骤:;离心法：离心后去上清，加培养液，吹 打，传代。 直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去1/2-2/3，加培养基，传代。;(二) 传代培养的注意事项;二、细胞系的建立;细胞系的维持;1、证明细胞系的种系。染色体分析、同工酶分析、DNA指纹技术。 2、明确细胞系的组织来源 细胞抗原标记的方法 3、细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化正常细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体。 4 、 细胞有无交叉污染 。同工酶方法是快速有效的，每一个细胞系在琼脂糖电泳上有特异的同工酶带型。DNA指纹技术也可以鉴定。 ;三 、细胞克隆;（一）克隆培养技术;;1.稀释铺板法：最常用 消化—低密度细胞悬液制备—接种—标记与培养—分离扩大培养—观察—移植瓶或皿内培养;;2、饲养层克隆法 饲养细胞（feeder cell）：也称滋养细胞，是一层经过射线或丝裂霉素C处理过的供其它细胞附着的细胞层。成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。 注意：3周内饲养细胞即死亡，要及时应用 ;饲养层克隆图解;3、胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法： 1）胶原膜板或血纤维蛋白膜板的制备 2）消化、稀释、接种和培养待克隆细胞 血纤维蛋白膜板制备 A液：0.2μg凝血酶,100ml培养液 B液:250mg 牛血纤维蛋白原、800mg NaCl、25mg 柠檬酸钠、1000毫升双蒸水 A：B=4：1 ;4、琼脂克隆法： 用于病毒转化细胞、恶性转???细胞。 2%琼脂母液--45℃水浴--混合成0.33%琼脂培养液加入试管内 2.5ml-- 45℃水浴 ;;5、在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化 2%琼脂母液--45℃水浴（琼脂母液和2倍浓度培养液）--1：1混合-- 45℃水浴—铺板—细胞悬液内加等体积的1.5%甲基纤维素混合后铺于琼脂层上培养 ;;（二）影响克隆形成率的因素;（三）克隆的分离;;1、概念：细胞系，细胞株，传代培养，细胞克隆，克隆形成率 2、鉴定细胞系应包含的内容 3、常见的克隆培养技术有哪几种，简要叙述其技术要点 4、影响克隆形成率的因素 5、克隆分离的方法和技术要点;