[生物学]第五章 原生质体培养.pptVIP

原生质体培养成功的首要条件是获得大量、完整、有活力的原生质体。 三、原生质体活力测定 形态识别 相差显微镜法 酚藏花红染色法 伊凡蓝染色法 FDA测原生质体活力的原理 四、 影响原生质体数量和活力的因素 1. 供试材料 2. 酶的种类、组合和酶解时间 3. 渗透压稳定剂 4. 质膜稳定剂 5. PH 6. 光照和温度 1.供试材料 虽然已能从各种植物组织和细胞中获得完整的原生质体，但植物种类、所选材料的生理和发育状态、供试材料的生长条件等因素均对分离出的原生质体数量和活力有很大影响。下列材料是较理想的分离原生质体的供试材料。 ① 自然生长的幼嫩叶片 这类材料取材方便，来源广泛，在适宜处理条件下，可以获得大量活性较高的原生质体。 ② 无菌实生苗子叶和下胚轴 种子易于灭菌，可以在短期内获得大量的供试无菌苗。子叶和下胚轴细胞年幼，具有较强的分裂和成苗能力，能产生较多的具高分生能力的原生质体。 ③ 外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培养物 这些材料不受外界环境的影响，试验重复性好，产生的原生质体产量、活性和稳定性等比较理想。 ④ 花粉细胞 花粉原生质体具有单倍体和原生质体的双重优点，花粉具有群体数量大、一致性好和取材方便等优点，是细胞工程中一种特殊的试验体系。 2. 酶的种类、组合和酶解时间 不同植物种类、组织和细胞由于细胞壁结构、组成不同，分解细胞壁所需酶的种类、浓度、组合及酶解时间也不同。 3.酶液渗透压 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外平衡，防止细胞吸水涨破和脱水邹缩（破坏内部结构）。 糖醇系统 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。但有的植物分离原生质体又是蔗糖的效果最好。 4. 质膜稳定剂 为了增加完整原生质体数量，防止质膜破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团，需在酶液中加入质膜稳定剂。常用： 葡聚糖硫酸钾 2-（N-吗啉）-乙烷磺酸 氯化钙 磷酸二氢钾 PH 酶液PH值：5.4-5.8 因为PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多 温度和光照 酶的最适温度40～50℃ 细胞最适生长温度25～30 ℃ 因此分离原生质体最适温度25～30 ℃ 另，由于脱壁的原生质体对光非常敏感，因此分离原生质体一般是在黑暗条件下进行。 第三节 植物原生质体培养 一、培养方法 固体薄层培养（平板培养法） 液体浅层培养 固液培养 二、影响原生质体培养的因素 三、原生质体再生 1、平板培养（固体薄层） 原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37?C左右）混合，培养于培养皿中。 1-1、饲养层培养 方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。 方法二：X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上。 1-2、共培养法 将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合 前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质 2、液体浅层培养 用培养基离心 用培养基悬浮 3、固、液培养 培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。 固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。 二、影响原生质体培养的因素 原生质体活力 原生质体密度 渗透压稳定剂 培养基营养 培养条件（温、光） 植物材料 原生质体活力 拥有大量具有活力的原生质体决定着原生质体培养能否成功。“影响原生质体活力的因素”？ 原生质体密度 原生质体接种时的植板密度对再生细胞的分裂具有很大影响，过高或过低，都不利于细胞分裂。常用的植板密度为104～105个细胞/ml。这种对密度的要求是细胞间相互关系的一种反映。因为有些代谢产物对细胞的发育是有利的，而有些是有害的，为了平衡这种关系，对细胞培养的起始密度就有一定要求。 渗透压稳定剂 在没有形成细胞壁之前，原生质体的培养必须有适合的渗透压保护。培养7～8天后，大部分有活力的原生质体已经再生出细胞壁并通过几次细胞分裂，形成了细胞团。 培养基营养 原生质体培养常用的培养基为MS、B5、NT、N6、MT或它们的衍生培养基。原生质体的培养基无机盐浓度应低于组织或细胞培养基，适当提高Ca2+、Mg2+含量而降低NO3-含量，有助于提高原生质体的稳定性，促进细胞分裂。 培养条件 光照 原生质体培养初期对光照要求严