第4章目的基因的获得.ppt

3：cDNA的合成 ① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成cDNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 5’ 反转录酶 mRNA cDNA 3’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 * * cDNA克隆中使用的反转录酶 AMV：来源于禽类的成髓细胞瘤病毒 MMLV：大肠杆菌中克隆的莫罗尼氏鼠白血病病毒 Native enzymes have poor processivity and intrinsic RNase activity, which leads to degradation of the RNA template.天然来源的酶缺乏持续合成能力，但具有内在的RNA酶活力，容易使RNA模板降解，不利于生产全长的cDNA The native enzymes function optimally at 37℃ and therefore tend to stall at sequences that are rich in secondary structure, as often found in 5’ and 3 ’ untranslated regions.(天然来源的酶，发挥功能的最适温度是37℃，且通常会在富含二级结构的序列出转录终止——这些结构往往出现在5端或3端的非翻译区（这样就不容易形成全长cDNA）) * * * 现在常用的酶：天然的酶改造过以利于生产全长cDNA Several companies produce engineered murine reverse transcriptases that lack RNase H activity, and these are more ef?cient in the production of full-length cDNAs. （现在常用突变了的反转录酶（老鼠病毒来源的），它们缺乏RNaseH活性，因此更有利于生产全长cDNA） An example is the enzyme Super-Script II, marketed by Life Technologies (Kotewicz et al. 1988). This enzyme can also carry out reverse transcription at temperatures of up to 50℃. (如： Life Technologies公司生产的改造后的Super-ScriptII可以在50 ℃下进行反转录。 ) 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶 引物 ② 降解mRNA模板 mRNA cDNA第一链 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 引物 或RNaseH 碱 cDNA第一链 5’ cDNA第二链合成 DNA聚合酶 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。 ③ cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ 核酸酶S1 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ ④去掉发卡结构 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ 5’ 3’ Development of cDNA cloning strategies An early cDNA cloning strategy, involving hairpin-primed second-strand DNA synthesis and homopolymer tailing to insert the cDNA into the vector.(早期的策略：发卡方法：引导cDNA第二链的合成) * * * Improved method for cDNA cloning. The first strand is tailed with oligo(dC) allowing the second strand to be initiated using an oligo(dG) primer. (改进的策略：寡聚加帽法：对cDNA第一链同聚物加尾后，设计相对应的引物合成cDNA第二链) * 早期cDNA策略 * * * mRNA的分离 Oligo(dT)引物与mRNA 退火，cDNA第一链合成 降解mRNA模板，cDNA3’末端形成双链发夹结构 以发夹结构为引物，合成cDNA第二链 用