GFP在绿色荧光裸鼠不同组织中的表达及分析.DOCVIP

GFP在绿色荧光裸鼠不同组织中的表达及分析 尤金炜，董敏，刘彪，梁磊，胡文娟，田小芸，方天，周森妹，赵志刚，恽时锋 （南京军区南京总医院比较医学科，全军实验动物科普与伦理教育基地， 全国科普教育基地，江苏南京，210002）目的：研究外源绿色荧光蛋白（Green Fluorescence Protein，简称GFP）基因在BALB/c绿色荧光裸鼠器官组织表达及方法：以及RT-PCR方法检测GFP的组织分布以及荧光表达水平情况。结果：经活体荧光影像系统观察及PCR方法检测发现GFP可以在裸鼠多个器官组织中表达，其中在胰腺、心脏、全脑、皮肤、睾丸中表达量较高。结论：外源绿色荧光蛋白可以在体内成功表达且稳定遗传，其中在胰腺组织中高表达。 近年来，无胸腺裸鼠作新的动物模型，活跃于免疫学、肿瘤学、毒理学等各领域的研究工作中，尤其在免疫生物学、免疫病理学、移植免疫、肿瘤免疫、病毒和细菌免疫等领域，在短短的几年中，就展开了一系列富有成效的新的研究，推动了各方面的工作，为实验免疫学、实验肿瘤学供了新的工具［1-3］。而来源于水母(Aequorea Victoria)的绿色荧光蛋白，它无需作用底物或共作用物，在荧光激发下可以直接发光，性质稳定，现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一［4-5］。 1980年，Gordon等［6］用显微注射转基因方法获得了2只转基因小鼠。1995年Ikawa等［7］采用绿色荧光蛋白报告基因，成功建立了绿色荧光蛋白转基因小鼠。2007年冯娟等［8］建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型。2013年，王贵利等［9］建立绿色荧光转基因大鼠，2013年，本科室张立波等［10］建立了绿色荧光转基因裸鼠。本实验针对这种动物模型，观察外源绿色荧光蛋白基因能否在裸鼠体内成功表达，并探讨荧光蛋白在该模型组织中的分布特点。 [基金项目]南京军区南京总医院课题(2012052) [作者简介]尤金炜（1983-），男，本科，南京军区南京总医院比较医学科技师。 [通讯作者]恽时锋（1965-），男，主任技师，教授，博士，研究生导师，从事医学实验动物学工作。 1 材料和方法 (specific-pathogen free，SPF)的饲养间【SCXK（军）2012-0014；选取49d及70d雄鼠各6只，动物使用许可证号为SYXK（军）2012-0047】。 1.2 仪器与试剂 主要仪器：IVIS Lumina XR型小动物成像系统(美国)荧光定量PCR仪Allegra 21R 台式高速冷冻离心机AR5120电子天平MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪雪花状制冰机移液器超净工作台TRlzol Reagen、RNase Inhibitor、Dnase I、RT mix、qPCR Master Mix、DEPC、SDS、Agarose、毛细管离心管枪头PCR反应管鼠GFP表达情况引物设计及合成表1 目的基因及内参基因的引物序列 Table 1 Primers of target and internal gene sequences基因 gene 引物序列(5′→3′) Primer sequence 正向引物 Forward primer 反向引物Reverse primer 扩增子(bp) amplicon GFP ACCTGTCCACACAATCTGCC CCATGTGTAATCCCAGCAGC 97 β-actin ATGTGGATCAGCAAGCAGGA AAGGGTGTAAAACGCAGCTCA 99 1.3.3 RNA提取反转录49d及70雄鼠解剖后，取胰腺、心脏、全脑、皮肤、睾丸、肠道、肺脏、肾脏、肝脏、脾脏等组织，TRIzol法提取样品总RNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，反转录反应条件的设置：25℃10min，42℃50min，85℃5min1.3.4 实时荧光定量PCR 将cDNA作为实时荧光定量PCR的反应模板，每个组织均作复孔以减少误差，以β-actin为内参基因作为对照。扩增条件为，扩增曲线：94℃ 5min；94℃ 20s，55℃ 30s，循环40次55℃单点检测信号。溶解曲线：95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s，连续检测信号。1.3.5实时荧光定量PCR数据分析 通过实时荧光定量PCR的方法，采用SYBR GREEN 染料法，以β-actin为内参基因，以49裸鼠胰腺组织作为对照组，2(-⊿⊿Ct)法对主要脏器组织中的GFP相对表达量进行计算。倍数差异=2(-⊿⊿Ct)使用SPSS13.0统计软件，采用t检验对数据进行差异显著性检验，统计结果以表示。 2.1 绿色荧光裸鼠的荧光表达情况 绿色荧光裸鼠在自然光线下，耳