现代生物化学技术-青岛大学.doc

现代生物化学实验技术 主编：杜卫、徐宏伟 青岛大学医学院 细胞与分子生物学实验室 2012年3月 实验一 考马斯亮蓝G-250染色法【实验目的】 学习掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。染料的最大吸收从465nm变为595nm蛋白质－染料复合物具有很高的系数一定范围内,溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，考马斯亮蓝试剂配制简单操作简便快捷灵敏度高重复性好显色迅速最低检出量为1ug蛋白质。染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。干扰物质较少。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，但去污剂如Tritonx-100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照消除。本法测定范围1-100μg。 【实验仪器及试剂】 仪器：722分光光度计、天平、试管、 2、试剂： （1）（2）标准牛血清蛋白质溶液：100 μg/mL牛血清蛋白：称取牛血清蛋白25mg，加溶解并定容至100mLμg/mL），吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100mL即可。 考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL　90%的乙醇中，加入100mL 85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容1L，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。【实验步骤】 1．标准曲线的绘制： 取6支试管，按表1加入试剂，混合均匀后，放置min后，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 表1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质溶液配制表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量（g） 0 20 40 60 80 100 min，在波长595nm比色，读取光密度2．样品中蛋白质含量的测定：准确称取鲜样2g，用2mL蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。在8000r冻离心10min，取上清液待测。另取一支试管，加入0.2mL样品提取液，加入0.8mL蒸馏水和5mLG-250溶液，充分混合，放置min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。?（ mg/g ） 中蛋白质含量的测定：0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀。(此法样品稀释200倍)。 摇匀，静置3min，在波长595nm比色，读取光密度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白质浓度g／ml＝稀释样品浓度×稀释倍数【】 5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。 2、测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 实验二 Lowry-酚试剂法测定蛋白质定量 【原理】 Lowry 法是双缩脲法（Biuret）和斐林（Folin）–酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜–蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。 Lowry 法除使肽链中络氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。 Lowry 法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对于不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的 SDS ）。 1. 双缩脲法的原理 双缩脲（ NH 2 – CO – NH – CO – NH 2 ）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。 双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10 mg 蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5 mg 以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如 Tris 缓冲液，因为它们产