CN107354123-CN201610305789-一种植物细胞规模培养方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 107354123 A (43)申请公布日 2017.11.17 (21)申请号 201610305789.0 (22)申请日 2016.05.10 (71)申请人 张杰 地址 100039 北京市海淀区蓝靛厂中路晴 雪园6号楼1单元201 (72)发明人 张杰　 (74)专利代理机构 南京艾普利德知识产权代理 事务所( 特殊普通合伙 ) 32297 代理人 陆明耀 (51)Int.Cl. C12N 5/04(2006.01) C12N 5/02(2006.01) 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 (54)发明名称 一种植物细胞规模培养方法 (57)摘要 本发明涉及一种植物细胞规模培养方法。本 发明公开了一种体外规模化悬浮培养扩增铁皮 石斛细胞的方法，其培养过程是：石斛带休眠芽 茎段，插入到适宜固体培养基上，待愈伤组织长 出后或胚状体诱导出后，将其剥离扩增，扩增后 将愈伤组织/胚状体进行匀浆酶解、研磨或喷雾 等理化手段分解为单细胞悬液，摇床培养，经数 次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器 中进行连续扩增10-25天，待达到生长密度后，通 过调节生物反应器中的指标、植物生长调节剂浓 度及比例、更换培养基成分等手段，最终达到每 20-50天收获一次，或者连续、半连续收获，多糖 A 含量达到20％以上，并保持常年稳定扩增的从 3 20L-吨级单元的大规模铁皮石斛细胞悬浮培养 2 1 4 连续扩增体系。 5 3 7 0 1 N C CN 107354123 A 权　利　要　求　书 1/1 页 1.一种体外规模化悬浮培养扩增植物细胞的方法，其培养过程是：将植物愈伤组织使 用常规方法进行扩增培养，得到扩增后的愈伤组织或胚状体，将愈伤组织或胚状体组织进 行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，将细胞种子按一定接种比例接种 到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，pH为5-7，固定光源光照10-20h，光照强 度2000-8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-25天，不同阶段的光质交替变换，所述的 光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3- 4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换 新鲜液体培养基一次。每15-25天收获植物细胞系培养物的30-50％，并补充相应比例的新 鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物 生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，生长素与细 胞分裂素比例控制在3:1，总浓度在0.05-5mg/L调整。 2.根据权利要求1所述的方法，所述基本培养基为MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White 或SH培养基。 3.根据权利要求1所述的方法，所述的液体培养基与更换的新鲜液体培养基中的植物 生长调节剂相同，均为IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT0.05-3mg/L，总浓度为0.05- 5mg/L。 4.根据权利要求1所述的方法，优选的，更换的新鲜液体培养基中植物生长调节剂为 IAA/NAA/IBA 0.05-3mg/L:KT 0.05-3mg/L:ABA 0.05-50ug/L，总浓度为0.05-5mg/L。 5.一种提高植物细胞系产量的体外规模化悬浮培养扩增植物细胞系方