CN107090433-CN201710290044-用于肿瘤治疗的T细胞培养方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 107090433 A (43)申请公布日 2017.08.25 (21)申请号 201710290044.6 (22)申请日 2017.04.28 (71)申请人 中卫华医（北京）医院管理有限公司 地址 101111 北京市大兴区经济技术开发 区科创六街88号亦庄生物医药园E1- 501 (72)发明人 赵进军　何文丽　邱丽媛　谷广其　 李亚平　王晶　 (74)专利代理机构 四平国泰知识产权代理事务 所(普通合伙) 22213 代理人 韩富刚 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) 权利要求书3页 说明书10页 (54)发明名称 用于肿瘤治疗的T细胞培养方法 (57)摘要 本发明涉及一种用于肿瘤治疗的T细胞培养 方法，为解决现有技术不能大量体外获得T细胞 的问题，其包括下列步骤：1）分离单核细胞：2）单 核细胞洗涤：3）单核细胞培养：根据前步骤中测 得的细胞总数，加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无 血清培养基，重悬；将CD3单抗包被好的透气盖细 胞培养瓶中的保护液吸出，再将细胞悬液转移到 包被过的细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置于培养箱 中37℃，5% CO 培养；4）Day 1-14扩增：T细胞后 2 期扩增：在T细胞后期扩大培养时用细胞培养袋 9 培养，最后扩增到1-3 ×10 以上即可；Day12无菌 检测：5）Day14 收获。具有可在体外培养条件下 A 获得大量的、应用安全的、纯度很高的细胞毒性T 3 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用 3 4 0 于临床的质量指标的优点。 9 0 7 0 1 N C CN 107090433 A 权　利　要　求　书 1/3页 1.一种用于肿瘤治疗的T细胞培养方法，其特征在于包括下列步骤：1）分离单核细胞： 在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心 管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧 盖子，离心；注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面； 将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心 管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细 胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移 到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀； 2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容，混 合均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀 即为单核细胞； 3）单核细胞培养：根据前步骤中测得的细胞总数，加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无血 清培养基，重悬；将CD3单抗包被好的透气盖细胞培养瓶中的保护液吸出，再将细胞悬液转 移到包被过的细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5% CO 培养； 2 4）Day  1-14扩增： T细胞前期扩增：细胞接种前三天无需镜下观察细胞状态；三天后，须每日镜下观察细 胞状态，观察的指标包括：细胞形态变化、数量变化、培养基颜色变化；一般情况下此时细胞 体积明显增大，形