CN106939345-CN201710263891-用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCRRFLP方法及应用.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 106939345 A (43)申请公布日 2017.07.11 (21)申请号 201710263891.3 (22)申请日 2017.04.21 (71)申请人 武汉科技大学 地址 430081 湖北省武汉市青山区和平大 道947号 (72)发明人 徐瑶　宋如晦　石伟林　代洋　 许娜　廖兴华　张同存　 (74)专利代理机构 武汉凌达知识产权事务所 (特殊普通合伙) 42221 代理人 刘念涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) 权利要求书2页 说明书7页 序列表1页 附图2页 (54)发明名称 用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷 酸多态性的PCR-RFLP方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测II型糖尿病易 感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法及 应用，首先，根据DNA池测序结果，检测到的基因 多态性包括：CREB1基因启动子区距转录起始点- 1354位T或G的单核苷酸多态性和 -1343位T或A 的单核苷酸多态性。以待测样本基因组DNA为模 板，以引物对P为引物，在Taq DNA聚合酶、Buffer （缓冲环境）、Mg＋＋、dNTPs存在的情况下，PCR扩 增包含多态位点的CREB1基因序列，然后将PCR产 物一分为二，分别用Hha I和Xsp I限制性内切酶 进行消化，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分型。 A 此外，将这两个多态位点与II型糖尿病的临床指 5 标关联分析，结果显示不同基因型与空腹血糖和 4 3 9 糖化血红蛋白水平显著相关。 3 9 6 0 1 N C CN 106939345 A 权　利　要　求　书 1/2 页 1.用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于： 以糖尿病患者和正常人的血液基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg＋＋、dNTPs 存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物对P进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对其进 行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性。 2.所述的聚合酶链式反应引物对P为： 上游引物P-F：5’- CCTGGAGTACCAGGAAGGACAGC-3’   23 nt 下游引物P-R：5’- TTACACGTATGAGCCACC-3’        18nt 引物P-F中带有下划线的碱基为错配碱基，目的是引入Hha  I的酶切位点； PCR扩增后，将产物一分为二，一部分PCR产物用限制性内切酶Hha  I进行消化，再对酶 切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定CREB1基因第-1354位的碱 基多态性；另一部分PCR产物用限制性内切酶Xsp  I进行消化，再对酶切后的片段进行琼脂 糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定CREB1基因第-1343位的碱基多态性。 3.根据权利要求1所述的用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR- RFLP方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件是：20 μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合 ++ 酶，2×Buffer  10 μL（内含Mg 、dNTPs等），0.45 μL基因组DNA，10 p