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2007-4-12 酶法分析 血液生化分析实验 单酶反应定量法 偶联酶反应定量法 一、单酶反应定量法 二、偶联酶反应定量法 血液胆固醇含量测定 P61 A500（460～560nm） 试剂 测定试剂：PBS buffer，过氧化物酶(POD)，胆固醇酯酶(COE)，胆固醇氧化酶(COD)，4-氨基安替比林(4-AA)，HBA(4-羟基苯甲酸) 蒸馏水 标准胆固醇溶液（5.17mmol/L） 待测标本 操作 临床意义 血液葡萄糖含量测定 P123 A500（460～560 nm） 试剂 测定试剂：PBS缓冲液，亚铁氰化钾，EDTA-Na2过氧化物酶(POD)， 葡萄糖氧化酶(GOD)，4-氨基安替比林(4-AA)，HBA 蒸馏水 标准葡萄糖溶液( 5.55 mmol/L) 待测标本 操作 临床意义 Biochemistry Experiment 3 P106 借助某种酶的作用，使被测物质定量地进行转变。在转化完成后，测定底物、产物或辅酶等物质的变化量。 分为单酶反应定量法 偶联酶反应定量法。 动力学分析法 终点测定法 酶标免疫测定法 方法 底物含量的测定 辅酶的定量 以脱氢酶作指示酶 以脱氢酶以外的酶作指示酶 1．底物含量的测定 底物的减少量 产物的增加量 辅酶的变化量 待测物质为底物，底物能接近完全地转化为产物，底物具有某种特征性质 NADH和NADPH在340nm波长处有特征性最大吸收峰，当氧化为NAD+或NADP+时在340nm波长处没有吸收。 被测物作为底物，底物基本上都能转变成为产物，产物又是具有可专一性进行定量测定的物质 2．辅酶的定量 辅酶的种类很多，由于它们在酶系统中非常重要，因而经常要对它们作定量分析。单酶反应可测定的辅酶有多种。 乙酰CoA + H3PO4 磷酸转乙酰基酶PTA CoA+乙酰磷酸 233nm 当单酶反应产物和原始底物用物理化学手段无法区分时，往往可借助另一种酶作为指示酶，通过偶联反应进行定量分析。如： A B C E1 E2 当测定A、B很困难时，可用E2作指示酶，通过测定C的含量来测定A。 胆固醇+O2 胆固醇氧化酶 H2O2+HBA+4-AA 过氧化物酶 +H2O 4-胆甾-3-烯酮+ H2O2 醌亚胺色素 胆固醇脂+H2O 胆固醇脂酶 胆固醇+脂肪酸 原理: 5 - - 血清样品 - 5 - 标准胆固醇 - - 5 蒸馏水 200 200 200 测定试剂 测定管 标准管 空白管 (μL) 取三支试管，按下表加入各试剂 各管混匀， 37 0C反应10 min， 以空白管调零，测A500 血清胆固醇浓度 = A测定管-A空白 A标准管-A空白 × 标准胆固醇浓度 血清胆固醇浓度范围：2.33-5.17mmol/L (90-200mg/dL) 临界高胆固醇血浓度：5.20-6.10mmol/L (210-239mg/dL) 高胆固醇血浓度： ≥ 6.2mmol/L (240mg/dL) 5.17mmol/L 胆固醇升高 胆固醇降低 原发性高脂蛋白血症、续发性高脂蛋白血症、如肾病综合症、糖尿病、肝胆疾病、甲状腺功能低下等。 贫血、甲状腺亢进、肝硬化、营养不良、疾病晚期、胆管炎等。 葡萄糖+H2O+O2 葡萄糖氧化酶 H2O2+HBA+4-AA 过氧化物酶 +H2O 葡萄糖酸+H2O2 醌亚胺色素 原理: 5 - - 血清样品 - 5 - 标准葡萄糖液 - - 5 蒸馏水 200 200 200 测定试剂 测定管 标准管 空白管 (μL) 取三支试管，按下表加入各试剂 各管混匀， 37 0C反应10 min， 以空白管调零，测A500 血液葡萄糖浓度 = A测定管-A空白 A标准管-A空白 × 标准葡萄糖浓度 参考值 血清或血浆： 3.89-5.83 mmol/L (70-105 mg/dL)