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酵母双杂交 学院：医药学院 专业：微生物与生化药学 学号：21140811040 姓名：崔小清 酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System 酵母双杂交系统是在1989年由StanleyFields和k-kyu Song首次提出并初步建立的在酿酒酵母体内分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统。 自建立已有153年的历史，已经逐步发展成一个较完善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统，并基于原初 的基本原理衍生了一系列类似的系统：酵母单杂交系统、反向双杂交系统、三杂交系统，还有人预测，将来还可能出现四杂交系统。报告基因的多样化，发展了双报告基因系统，可靠性增大，敏感性增强。 在生物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期，都离不开蛋白质间的相互作用，自酵母双杂交系统创建以来，已经成为研究蛋白质相互作用的重要手段，并揭示了大量未知蛋白质之间的相互作用。 相关知识： 在结构基因的上游、下游或内部有一些调控成分，并依靠特定的蛋白因子结合与否调控基因的转录。 1、顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，作用是参与基因表达的调控。 2、反式作用因子（转录因子）：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 3、报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。 基本原理 真核生长转录因子含有两个结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成的结构域： 转录激活结构域(AD) (activation domain) DNA结合结构域(BD) (DNA binding domain) 转录激活因子 BD：识别DNA上特定序列，转录激活域定位调控 基因的上游。 AD：与转录复合体其他成分作用，从而启动所调节基因的转录。 两个结构域分开时仍具有功能，但不能激活转录，只有他们以适当 途径在空间上较为接近时，才能具有转录因子活性，激活报告基因的表达。（可为不同转录因子的BD和AD） 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达，探测蛋白-蛋白的相互作用。 酵母双杂交原理示意图 X RNA Polymerase DBD Reporter gene Prey Bait AD Y Expression UAS 2. 拆开 Domain DNA binding domain Active domain 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 结合 用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。 不能转录 3. 重组Domain 用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。 Active domain 蛋白A 蛋白B DNA binding domain 在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。 通过效应基因是否被激活来检查： 4. 观察报告基因表达 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 蛋白A DNA binding domain 转录激活domain 蛋白B GAL4的DB domain与AD Domain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。 不能转录 （1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合 上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因 蛋白A DNA binding domain 转录激活domain 蛋白B 激活转录 GAL4的DB domain与AD Domain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。 转录表达 （2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合 实验步骤 一、构建双杂交体系的宿主菌 删除基因组中的内源野生型GAL4基因，使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。 二、构建报告基因（reporter gene） GAL4的效应基因是his3。 GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。 三、构建双杂交体系的穿梭质粒 1. 穿梭质粒（shuttle plasmid）：既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。 2. 双杂交体系需要两种穿梭质粒： 分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。 （1）BD-plasmid 靶基因(蛋白A基因)按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。 筛选标志：TRP （2）AD-plasmid 蛋白B基因按正确阅读框 克隆到GAL4的AD片断