第二章基因工程常用技术.ppt

基因工程常用分子生物学技术 第一节 凝胶电泳技术 一、电泳的原理 二、琼脂糖凝胶电泳 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 第二节 探针技术 一、核酸探针 1. 双链DNA探针 ⑴ 切口平移法 2. 单链 DNA 探针 ⑵ 从 RNA 合成单链 cDNA 探针 3、寡核苷酸探针 4、RNA探针 二、非核苷酸探针 三、探针的标记 第三节 核酸分子杂交技术 一、萨瑟恩DNA印迹杂交 步骤： 二、诺赛恩RNA印迹技术 三、菌落杂交 四、ELISA 第四节 PCR技术 一、PCR技术的原理 PCR步骤： 二、PCR反应中的几种成分 1、Taq DNA聚合酶 2、关于 PCR 引物 3、用于 PCR 扩增的模板 4、用于 PCR 扩增的 dNTP 第五节 DNA 序列测定 一、Sanger 双脱氧链终止法 二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法 （一）原理 （二）步骤 三、DNA大片段的连续测序 四、DNA序列分析的自动化 第六节 寡核苷酸片段固相合成 一、用于寡核苷酸化学合成的单体 二、寡核苷酸片段合成的步骤 第七节 分子标记技术 二、RAPD技术 （一）RAPD 的基本概念和原理 (三) RAPD 的基本实验程序 三、AFLP 四、SSR技术 五、 mRNA 差异显示反转录 PCR 技术 生物能快速、精确地复制自身的 DNA，但这种精确性是相对的。实际上，在植物的自然群体中存在大量的 DNA 序列变异。如：碱基对的代换、缺失等。几乎不可能有两个生物体 DNA 的碱基序列是相同的。 限制性内切酶酶解 DNA 长链，是识别 DNA上的特异的位点并在这些位点上切断的过程。酶识别位点碱基对越少，DNA 分子中被识别的位点越多，所产生的限制片段越短。 来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA 分子，都会在同样的位点被准确切割。但是在不同物种、不同品种、甚至同一品种的不同的两个个体之间，DNA 会发生变异，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制片段长度的多态性。 用限制性酶来酶解植物核 DNA 会产生数万个片段，其大小变化是连续的，如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果。然而，各限制片段在凝胶中还是分开的，但不能分辨。进行Southern 印迹转移操作，用特定的探针与滤膜上的 DNA 杂交，经过放射自显影就能检测到高等植物核 DNA 的 RFLP。 0.1kb 0.2kb 0.4kb 0.5kb 0.3kb 0.4kb 0.5kb × (1) (2) 0.2kb 0.3kb 0.5kb 品系1 品系2 0.4kb 0.1kb + – 3、RFLP的方法与步骤 （1）DNA 的分离 （2）酶切 （3）琼脂糖凝胶电泳 （4）Southern 印迹转移 （5）DNA 杂交及放射自显影 可用 CTAB 法或 SDS 法。 一般根据基因组总 DNA 的复杂性选用限制酶。 1990 年，由美国杜邦公司的科学家 Williams 推出。 与 RFLP 相比的优越之处：检测效率高、样品用量少、灵敏度高等。 缺点： （1）由于采用的引物的 Tm 值较低，扩增结果易受外界因素的影响，实验的重复性差。 （2）RAPD 为显性标记，不能提供完整的遗传信息。 RAPD 的引物: （1）为随机引物， （2）序列较短（通常为10个核苷酸） （3）为一个寡核苷酸单链引物 RAPD 方法是在 PCR 技术基础上发展起来的，它利用一系列单个随机引物（通常为 10 个核苷酸），对所研究的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，引物与基因组 DNA 某一区段互补时，就与其结合，就可对引物下游 DNA 进行合成，即扩增。 0.2kb 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.5kb 0.3kb × 0.2kb 0.3kb 0.5kb 品系1 品系2 1. DNA 的提取 （1）碱法 （2）CTAB 法 （3）SDS 法 2. 模板 DNA 浓度和质量的检测 3. PCR 扩增 4. 电泳检测：PCR 结束后每个样品加 4ul 凝胶上样缓冲液，每个泳道点样 20 ul。 5. 将凝胶浸于 1ug/ml 的 EB 中30 min~60 min，用水清洗约 10 min。 6. 观察、拍照。 其原理是： 以DNA的一条链为模板，在有 RNA 引物、4 种脱氧核苷酸（dNTP）时，和 DNA 聚合酶的条件下，在引物所结合的位置向 3’方向合成新的互补链。其反应以双链 DNA 的变性、退火、延伸为一个循环。经过多次循环（25～ 30 次），便目标 DNA 片段得以大量扩增。由于每一次