莱茵衣藻产氢.pptVIP

衣藻叶绿体中表达豆血红蛋白lba基因对其产氢影响的初步研究 豆血红蛋白 存在于大豆根瘤中的根瘤菌(以类菌体的形式存在)的固氮酶对氧十分敏感，必须在兼氧的条件下才有固氮的活性，在高氧或者无氧的环境中是没有活性的.但是存在于根瘤菌周围的豆血红蛋白可与氧进行可逆性结合，在类菌体的周围起氧缓冲的作用，成为阻止过多的游离氧接触固氮酶的屏障，豆血红蛋白还作为氧的载体，负担着在低氧环境中为类菌体呼吸提供氧的任务，使固氮酶免受氧的损害，保持高效的固氮活性。因此本研究将豆血红蛋白转入衣藻叶绿体中表达，利用豆血红蛋白与氧气可逆结合的性质，尝试在衣藻叶绿体中模拟大豆根瘤细胞的环境，创造一个低氧气环境的同时，结合部分抑制PSII活性的措施；提高光合电子传递效率，提高衣藻产氢效率。 衣藻叶绿体外源基因的转化原理 衣藻叶绿体外源基因转化的方法 莱茵衣藻叶绿体转化的方法主要有基因枪法和电击法。基因枪法又称高速微粒轰击法，是在真空室中利用基因枪传递的高压氦气加速包被着DNA片断的金属微粒(金粉或钨粉)轰击受体细胞，这种方法转化效率高、重复性好、操作简便、适用于各种细胞类型，因而可用于衣藻的核转化、叶绿体转化和线粒体转化。电击法又称电脉冲法，是利用脉冲电场瞬间作用改变细胞膜的状态和通透性，形成可逆的瞬间通道，外源DNA通过通道进入细胞。该法操作简单快速、转化效率高、无菌操作容易控制，也常常用于细菌和高等植物的转化，转化效率同玻璃珠法相似。 实验方法 豆血红蛋白基因的克隆 ①大豆总RNA的提取 称取大豆成熟的根瘤o．1g，液氮研磨，抽提大豆的总RNA ②RNA浓度和纯度的检测将总RNA稀释50倍左右，用紫外分光光度计(Eppendorf@BioPhotometer) 读取)OD260和OD280值，计算RNA浓度和纯度。 ⑤豆血红蛋白基因lba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA的克隆 (1)根据NCBI发表的lba基因序列(V00453／J01299)、lbc1-cDNA基因序列(V00452／J01300)、lbc2-cDNA基因序列(V00452／J01301)、1)、Flbr-cDNA基因序列($70187)的序列分别设计相应的特异性引物 (2)PCR反应体系：根据以上lba、lbc1， lbc2、Flbr的cDNA序列所设计的特异 性引物(合成引物加适量的ddH20溶解， 使其终浓度为10umol／L)以Soybean 总eDNA为模板，利用常规PCR技术分 别扩增出Iba-cDNA、Ibc1-cDNA、 Ibc2-cDNA 、Flbr-cDNA的基因片段。 (3)PCR反应条件：94℃预变性5min，一个 循环；94℃变性1min，62 ℃(1ba,lbc1, lbc2)、退火3.0s，72℃延伸lmin；30 个 循环；72℃延伸10min，PCR产物4℃保 存 备用。 (4)PCR产物的鉴定：用1％的琼脂糖凝胶 电泳 鉴定DNA的大小。如果大小正确, 则将PCR产物纯化后连接到通用载体 pEGM—Easy—TVector(Promega) (以下简称Tvector)‘上，再送测序公司检 测PCR产物碱基序列的正确性。 (5)PCR产物的纯化：DNA胶回收(TakaraAgaroseGelDNAPurificationkit)：电泳结束后， 切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，放入1．5ml离心管中， 加入3倍体积BindingBuffer，5℃水浴10min直至彻底 融化；将融化的胶溶液转移到柱中，室温放置2min， 8000 r／min离心l min，弃收集管中的废液；取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管中，加入500ul‘WashSolution，8000‘r／min离心1min；重复清洗二次(重复步骤5)后将UNIQ-10柱子放入一新的1．5ml的离心管中，在柱子膜中央加30uLElutionBuffer(PH7)，室温放置2 min 12000r／min离心1 min，离心管中液体即为回收的DNA片段，可立即使用或．20℃冷藏备用。 载体的构建 质粒DNA的制备(碱裂解法小量制备质粒DNA) 收集培养过夜至对数生长后期的菌液，用STE缓冲液洗去培养基；菌体悬浮于预冷的溶液I，激烈振荡，．使细胞完全分散：冰浴，加入新鲜配制的溶液lI，快速颠倒离心管几次，使内容物充分混匀；冰浴，加入预冷的溶液III颠倒离心管温和振荡，使内容物混匀，冰浴；离心，吸取上清移至另一