同工酶分析技术81淀粉胶电泳的技术和方法.PDFVIP

第 8 章 同工酶分析技术 由于酶是基因编码的产物，它在电场中迁移率的改变反映了酶蛋白的大小构形和肽链氨基 酸的序列变化，即编码 DNA 顺序上的变化，所以可通过分析酶谱的变化来获得我们所需要的遗 传信息。在酶谱分析中，等位酶是常用的分析工具。等位酶（Allozyme）是“等位基因酶” 的 简称，是从同工酶中派生出来的，它与同工酶既有区别又有联系。同工酶是催化同一生化反应 的、但在电场中的运动性质有所不同的同种酶的不同表现形式。这是由于构成蛋白质亚基的氨 基酸组成和顺序有所不同而造成的。这一概念是广义的，它包括不同基因座位和同一基因座位 的不同等位基因所编码的同一种酶，以及转录后酶变体的所有电泳后的表现型。近期文献所提 到的同工酶则是狭义的，仅指由不同基因座位所编码的同一种酶的不同形式。由于多数酶的不 同形式是共显性的，一个基因座位上两个或多个等位基因是能表达的，它们所编码的多肽链在 凝胶上作为酶基因的表现型都能显示出谱带而被看见，因此可将它们作为遗传学研究对象。以 下将介绍同工酶分析的一些技术和方法。 8.1 淀粉胶电泳的技术和方法 电泳有很多种支持介质，其中淀粉是最容易使用的一种。由于淀粉凝胶孔径的大小和蛋白 质分子相近，因此它提供了一个很好的分子筛。同时每一块胶都可以切成几片进行不同酶系统 的染色，因而节约时间、人力、物力和财力。淀粉胶电泳不需要任何复杂的装备，所有必须的 装备都能在实验室找到。而且，与聚丙烯酰胺比较，淀粉是无毒的，最重要的一点是，淀粉胶 上显色的结果和聚丙烯酰胺胶显色的结果一样好，多数时候甚至更好。 8.1.1 淀粉胶的制备 8.1.1.1 水解淀粉 进口水解淀粉价格昂贵。我们实验室用自己水解的淀粉（除淀粉酶用进口淀粉或者聚丙烯 酰胺胶外），进行蛋白质和酶的电泳，其效果一般都比较理想。水解方法如下： 器具：三角烧瓶（5 000ml），真空泵，布氏漏斗（5 000ml，直径 25～30cm）和布氏漏斗同 直径的圆形滤纸，37℃烘箱，移液管。 过程：将 2 500ml 丙酮（化学纯）和 35ml 浓盐酸（12mol／dm3 ）倒入三角烧瓶（3 000～5 000ml）中。用瓶塞或保鲜膜盖住三角烧瓶，在烘箱内加热至 37℃后，加 2 000g 马铃薯淀粉 混匀。水解时间因淀粉生产厂家不同而异（从数十分钟到 4 小时）。国内厂家生产的马铃薯淀粉 水解时间一般为 25～40 分钟。我们使用的马铃薯淀粉为浙江湖州食品化工联合公司菱湖 本章作者：聂 龙，唐顺学，贾 旭 72 遗传多样性研究的原理与方法 食品化工厂生产，水解时间为 35 分钟。每间隔 10 分钟摇匀一下，以悬浮淀粉。 加 1000ml lmol／dm3 乙酸钠，混匀，以终止水解。室温静置淀粉水解液半小时，弃去上清液。 将处理过的淀粉倒入有 2～3 张圆形滤纸的布氏漏斗内，连通真空泵。用 5 000ml 去离子水洗涤 水解过的淀粉，并用三角烧瓶装 3 000ml 去离子水静置淀粉过夜。 第 2 天，用AgNO3 检查是否还有残余 Cl-（一般无），再用 15 000ml 去离子水分 3 次充分洗 涤淀粉，最后用 5 000ml 分析纯丙酮抽滤（主要为吸收水分）。 将淀粉在一个不锈钢的大盘（或瓷盘）上铺一薄层，置 37℃烘箱中烘干（24～48 小时）。 8.1.1.2 制备淀粉胶 淀粉胶是通过煮沸水解淀粉和相应的缓冲液的混合物制成的。电泳缓冲系统包括两种缓冲溶 液：胶缓冲液，用于胶的制备；电极缓冲液，在电泳迁移的时候用来连接电极和胶。缓冲条件的 选择对电泳的效果有较大的影响，其中 pH 值与离子强度是两个重要因素。所选择的缓冲系统的 pH 值一般高于酶蛋白的等电点。酶蛋白带负电，提高 pH 值就会增加净负电荷总数而加快电泳速 度。也可以通过提高凝胶的 pH 值，使凝胶的 pH 值与电极缓冲液的 pH 值之间有一定的差距，使电 泳时跑在后面的蛋白质分子因电泳基质环境的 pH 值先降低而前进速度减慢，而在前面的蛋白质分 子仍以高速度前进，从而使它们之间拉开距离以提高分辨率。电泳缓冲液的不同离子强度也会影 响电泳效果。增加离子强度，会使