T-DNA插入双突鉴定.ppt

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 实验目的 提取植物基因组DNA的方法 PCR操作方法 琼脂糖凝胶分离核酸方法 鉴定纯合子为进一步实验做准备 Ti-质粒与植物基因组的相互作用 Ti质粒和T-DNA Ti质粒毒性区基因激活及T-DNA复合物生成 T-DNA插入鉴定的原理 （以拟南芥为例） DNA提取液 离心 异丙醇沉淀 冰浴离心 洗涤干燥 具体步骤 提取缓冲液：200mM Tris-Hcl(PH7.4); 25mM EDTA(PH8.0); 250mM Nacl; 0.5%SDS (1) 取拟南芥两片叶子，置于1.5ml离心管中，加入700ml 提取缓冲液； （2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色； （3）在台式离心机上12000 rpm离心10分钟； （4）离心后将上清转移至一个新的1.5 ml离心管中； （5）在上清中加入700ml异丙醇，混匀后放入-20℃ 30分钟 然后12000 rpm条件下，离心10分钟； （6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温过夜干燥； （7）100 ml dd H₂O PCR-引物设计 /tdnaprimers.2.html 以salk_080951为例： LP： TTCACAGTTTCAACGTTGTGG RP： GTAGCGTGATTTCGAGTTTGG BP： PCR-原理与程序 Condition 94 ℃ 5 min 94 ℃ 15sec 56 ℃ 15sec 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10min 4 ℃ forever 30cycle PCR-体系 20ml 10*buffer 2 *20=40 dNTPs 0.3 6 Primer 0.3*2 6*2 Taq 0.2 4 dd H₂O 13.9 278 DNA 3 单加 PCR-产物 用LP+RP产生大片段：1107bp 用LB+RP产生小片段：560-860bp 琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳 电泳流程 （1） TAE-配方 PCR产物中加入适量的londing buffer,加入点样孔。 电压：150V 电流：30mA 功率： 45W