tir区密码子选择对d-氨基酰化酶表达影响的研究.pdfVIP

目 录 目 录 中文摘要I ABSTRACT II 第一章 前言 1 1.1 密码子偏爱性2 1.2 原核表达体系的特点2 1.3 原核表达体系的影响因素3 1.3.1 转录水平上主要因素3 1.3.2 翻译水平上的主要因素4 1.4 翻译起始区TIR 对原核表达体系的重要意义5 1.4.1 翻译起始区及其自由能5 1.4.2 TIR 区自由能及二级结构与G+C 含量的关系5 1.4.3 密码子偏好性对于原核表达体系的重要性6 1.5 TIR 区简并密码子选择国内外研究现状8 1.6 D-氨基酰化酶 10 1.6.1 D-氨基酰化酶的发现 10 1.6.2 D-氨基酰化酶的来源 11 1.6.3 D-氨基酰化酶的性质 14 1.6.4 D-氨基酰化酶的应用 16 1.6.5 Alcaligenes 来源的D-氨基酰化酶与D-缬氨酸21 1.7 本研究的目的意义22 第二章 材料和方法24 2.1 实验中用到的试剂24 2.2 实验中用到的仪器25 2.3 引物的溶解26 2.4 密码子的替换26 2.5 MRNA 翻译起始区二级结构的预测26 2.6 点突变26 2.6.1 DA-PCR 26 2.6.2 OE-PCR 27 2.7 载体构建与测序28 2.7.1 质粒提取28 目 录 2.7.2 限制性内切酶消化29 2.7.3 重组载体的连接29 2.7.4 重组载体的热激转化30 2.7.5 阳性克隆的菌落PCR 法鉴定31 2.8 外源蛋白的表达与活性测定32 2.8.1 外源基因的诱导表达32 2.8.2 D-aminoazylase 的酶活力测定32 第三章 结果与讨论33 3.1 同义密码子的选择33 3.2 同义密码子编码的SGSA 序列33 3.3 TIR 区MRNA 二级结构37 3.4 TIR 区密码子选择对D-AMINOAZYLASE 表达的影响39 3.4.1 实验分组39 3.4.2 TIR 区密码子选择对D-aminoazylase 表达的影响39 第四章 结论44 参 考 文 献46 致谢52 中文摘要 中文摘要 D-缬氨酸，化学名为 D-2-氨基-3- 甲基丁酸，是合成抗生素、生理活性肽、 农药等多种产品的重要原料，广泛应用于医学、生物和农业等研究领域，D-缬氨 酸应用带动了其制备技术研究的发展。D-型氨基酸的制备方法主要有两类：一是 利用酶或化学不对称合成，二是通过化学法外消旋后进行手性拆分。N-酰基-D- 氨基酸酰胺水解酶 (D-氨基酰化酶，3.5.1.81)催化的手性拆分是目前制备D-型氨 基酸的主要途径。不同来源的 D-ANase 对不同底物的催化效率差别较大，其最 适作用底物一般为D-Met 、D-Leu 及D-Phe 的N-酰基衍生物，但是对于手性合成 领域中作为重要有机手性源的D-缬氨酸的N-酰基衍生物，部分D-ANase 转化效 率较低。以D-缬氨酸作为衡量指标，Alcaligenes 属来源的D-氨基酰化酶活力最 高。 将来源于Alcaligenes A-6 的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子 替换，利用化学和基于PCR 技术的酶促方法进行基因全合成，利用pET-32a 构 建重组表达载体 pET-trx-dan ，转化进 E.coli