PfuDNA聚合酶常见问题.docVIP

Pfu DNA聚合酶------常见问题 1、Pfu DNA聚合酶的精确度如何？ 因为具有3′--5′外切酶（校对）活性，Pfu DNA聚合酶是现今所描述过的所有热稳定酶中精确度最高的一种。普洛麦格公司的Pfu DNA聚合酶的出错率大约是1×10-6/每碱基对，而Taq DNA聚合酶的出错率大约是1×10-5/每碱基对。普洛麦格公司推荐将Pfu DNA聚合酶使用在那些需要高精确度的PCR应用中，包括克隆、基因表达和突变分析。 2、Pfu DNA聚合酶产生平未端PCR片断吗？ 因为天然的校对活性，Pfu DNA聚合酶产生的PCR片断是平未端的。收集到的有关Pfu DNA聚合酶的数据表明90%的PCR产物是平未端的。这种特性极大地提高了平未端连接的效率。 3、Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物怎样才能被克隆到普洛麦格的T-载体上？ 平未端DNA片断在经过修饰后，也就是在dATP存在的情况下，使平未端片段与Taq DNA聚合酶共同保温，就能促进其被克隆进T-载体。普洛麦格公司的pGEM?-T和pGEM?-T easy技术手册（TM042）中有讲述尾端加A的操作程序。 4、Pfu DNA聚合酶的PCR反应条件与常规PCR反应条件有什么不同？ 为了减少由3′-5′外切酶活性引起的引物降解，普洛麦格强烈推荐在冰浴上添加所有试剂并且在温度达到60-65°C时加入Pfu DNA聚合酶以便进行