(精编)PCR常见问题教学课件.pptVIP

PCR常见问题、原因分析及其对策 北京天为时代科技有限公司 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 PCR常见问题之一 无扩增产物 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 现象：正对照有条带，而样品则无； PCR常见问题之三 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 PCR常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行