植物叶绿素的提取分离及理化性质分析.pptVIP

《植物生理学实验》 植物叶绿体色素的提取 及理化性质的鉴定 一、实验目的 1.掌握叶绿体色素的有机试剂提取与纸层析分离方法。 2.了解植物叶绿素的重要理化性质及其在光合作用中的重要作用。 二、实验原理 1、植物叶绿素的主要种类 高等植物：Chl.a、b 褐藻、硅藻： Chl.a、c1、c2 红藻：Chl.d 植物叶绿体色素 叶绿素 叶绿素a：蓝绿色 类胡萝卜素 胡萝卜素：橙黄色 叶绿素b：黄绿色 叶黄素：鲜黄色 收集传递转换光能 收集传递光能，保护叶绿素 2、叶绿素的理化性质 卟啉环头： 4个吡咯环， 4个=CH-， 1个Mg2+; 亲水性。 II III IV Ｉ V Chl.a C55H72O5N4Mg Chl.b C55H70O6N4Mg 叶绿醇尾： 4个异戊二烯单位组成的双萜; 亲脂性。 脂溶性： 难溶于水,溶于酒精、丙酮、石油醚等有机溶剂。 皂化反应: 　叶绿素是双羧酸的酯，一个羧基被甲基酯化，另一个羧基被叶醇基酯化而发生皂化反应。 取代反应： 在弱酸情况下，卟啉环中的Mg2+可被H+、Cu2+、Zn2+取代。 光学特性： 吸收光谱 叶绿素有2个吸收高峰： 红光区640～660nm(叶绿素特有） 蓝紫光区430～450nm（卟啉环共有） 荧光与磷光现象： 透射光 反射光 荧光与磷光产生的原理 3、类胡萝卜素的理化性质 分子结构式： 胡萝卜素：C40H56 ，是不饱和碳氢化合物，有α、β、γ三种同分异构体。 叶黄素：C40H56O2，是胡萝卜素衍生的醇类，其两端的紫罗兰酮环第4位C上的H被OH取代。 脂溶性： 不溶于水，溶于有机溶剂。 光学特性： 最大吸收蓝紫光，不吸收红光。 植物叶绿体色素的主要性质 种　类 颜色 溶解 性质 作用 最大 吸收光谱 荧光 现象 磷光 现象 叶 绿 素 Chla 蓝绿色 不溶于水，溶于有机溶剂如酒精、丙酮、石油醚等 收集、传递、转换光能 640-660nm（红光）、430-450nm（蓝紫光） 透射光：绿色 反射光：红色 寿命短（10-9s） 暗红色光；寿命较长 10-2s Chlb 黄绿色 类 胡 萝 卜 素 胡萝 卜素 橙黄色 不溶于水，溶于有机溶剂 收集传递光能、保护叶绿素分子 蓝紫光 有 叶黄素 鲜黄色 三、实验试剂与材料 试剂： 石油醚（沸程60～90℃）、丙酮、甲醇、氢氧化钾、石英砂、碳酸镁、氯化钠、醋酸铜、盐酸或醋酸等。 仪器和器皿： 电子天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、分液漏斗、量筒、试管等。 材料：新鲜菠菜叶片等。 四、实验操作流程图 丙酮研磨提取叶绿体色素 　　 ↓过滤、洗研钵漏斗 ↓ ↓ ↓ 丙酮提取液2~3ml 荧光 余下的用石油醚萃取 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 逐滴加酸 纸层析 荧光 皂化反应 光破坏 （脱镁） ↓ ↓ 分离色素 Cu取代 ↓ 扫描光谱 1、色素提取步骤 叶片10g+丙酮20ml（分次） 迅速充分研磨成浆、过滤（小块脱脂棉） 加少许石英砂、少许碳酸镁 滤液 丙酮10ml洗研钵、漏斗 留2-3ml 纸层析 取代反应 40ml石油醚萃取 加50ml蒸馏水 轻摇、静置、分层清晰 （若乳化，加少许NaCl) 观察荧光 弃下层（丙酮+水层） 加50ml蒸馏水 弃水层 加50ml蒸馏水 弃水层 石油醚色素提取液（暗处保存） 荧光、皂化反应、光破坏 色素纸层析分离（可按自己的方案做）： 层析纸（滤纸）一端剪成长1.5cm、宽0.5cm，在距底端2cm处用铅笔轻轻划一横线（如右图）。 用毛细管吸取丙酮色素提取液在横线处画滤液细线（一定要细且直），如色素颜色不浓，可等干后再画1-2次。色素浓度高，效果好。 2、理化性质观察 1.5cm 0.5cm 取一个小量筒，加层析液3-5ml（石油醚：丙酮=9:1），在上过样的滤纸条上端穿一小孔，然后用毛细管或回形针穿过小孔，吊着滤纸条放入量筒，尖末端（约0.3cm）浸入层析液中（注意：一定不可将滤液细线浸入，滤纸不要碰到管壁），再用培养皿盖住。可观察到层析液沿滤纸条上升，离上端1-2cm或色素条带分离清晰时取下滤纸条、风干，观察4条色素条带颜色，从上到下依次为胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b。 分别剪下叶绿素a、b条带，并用1ml丙酮溶解，以丙酮做对照，在400-700nm间，每隔2nm进行光谱扫描。 光破坏： 取少量石油醚