Dig-Southern检测试验报告2010.10.31.docVIP

1实验结果报告单 所用试剂、耗材： 北京美莱博医学科技有限公司 北京美莱博医学科技有限公司I内切酶，HindⅢ内切酶： Fermentas（MBI）公司；6×DNA电泳上样缓冲液：北京美莱博医学科技有限公司； 北京美莱博医学科技有限公司； ；10mM dNTP：北京美莱博医学科技有限公司； DL2000分子量标准：北京美莱博医学科技有限公司； 琼脂糖：西班牙Biowest公司； AXYGEN耗材：10μl/200μl/1000μl无RNA酶吸头；0.2ml薄壁PCR管；Takara TP600型梯度PCR仪：日本Takara公司； H1650-W台式微量高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司； 超净工作台：北京鑫宏程洁净工程技术有限公司 电泳仪：上海申能博彩生物科技有限公司电泳槽：JY-SP-B型，北京君意东方电泳设备有限公司； 电泳仪：上海申能博彩生物科技有限公司凝胶紫外分析仪：JY02S型，北京君意东方电泳设备有限公司； 移液器：2.5μl/100μl/200μl/1000μl，Eppendorf公司取扩增产物各(l，DL2000分子量标准5(l/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存 M：DL2000 1:标记的探针 2：对照 五、基因组DNA酶切 1、酶切体系： 10×buffer： 7ul EcoRI内切酶： 6ul 样品DNA： 55ul 补足水至 70ul 10×buffer： 7ul HindⅢ内切酶： 6ul 样品DNA： 55ul 补足水至 70ul 于37℃温箱中酶切20h。 2、电泳 琼脂糖、1%胶浓度、TBE buffer（EB染料电泳后染） 3、电泳结果 M：1KB DNA Ladder； 1：2（EcoRI）； 2：2（HindⅢ）； 3：7（EcoRI）； 4：7（HindⅢ）； 5：15（EcoRI）； 6：15（HindⅢ）；7：17（EcoRI）；8：17（HindⅢ）； 9：52； 10：52； 11：+CK； 六、转膜 将胶裁成9.5×11.5cm大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次。 加入100ml 0.25 mol/L的盐酸脱嘌呤，室温振荡30 min。再加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡30 min。 用蒸馏水冲洗2次。加入中和液（1.5mol/L NaCl、1.0mol/L Tris-Cl , pH7.4）室温振荡2×15min。 用蒸馏水冲洗2次。加入2×SSC平衡凝胶和硝酸纤维素膜5min。 转膜（向上毛细管法，参照《分子克隆》）26小时。取下膜作好标记，在 2×SSC中漂洗一次， UV交联仪上照射固定DNA（5000μJ/cm2）。 取出后标记对应分子量标准位置。 七、杂交 1、预杂交：取11.0ml Hyb高效杂交液（Hyb-100），加入杂交管中，60℃杂交炉中预杂交2h。 探针变性：探针在PCR仪中100℃变性10分钟，立即放冰水浴冷却5min。 杂交：排尽预杂交液，在11.0ml Hyb高效杂交液（Hyb-100）加入6.0μl新变性好的探针，混匀。60℃杂交仪中杂交过夜。 八、洗膜、信号检测（使用美莱博DIGD-110“地高辛杂交检测试剂盒I (化学显色法)” ） 1、杂交后室温下，20 ml 2×SSC/0.1%SDS 洗膜2×5min。 2、50℃，20 ml 0.1×SSC/0.1%SDS洗涤2×15min。 3、再将膜置于20ml洗涤缓冲液中平衡2-5min。 4、将膜在10 ml封闭液中封闭30min（在摇床上轻轻摇动）。 5、Anti-Dig-AP 在10000rpm下离心5min。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶5000)，2.0μl Anti-Dig-AP加入10 ml封闭液混匀。 6、封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的10 ml抗体溶液，浸膜至少30min。 7、去除抗体溶液，用20 ml洗涤缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min。 8、去除洗涤缓冲液，在15 ml检测液中平衡膜2次，每次2min。 9、用检测缓冲液稀释300μl NBT/BCIP化学显色底物，在约15ml新鲜制备的显色液中反应显色。 10、用TE 缓冲液洗涤5 min终止反应，照相记录结果。 九、实验结果： M：1KB DNA Ladder； 1：2（EcoRI）； 2：2（HindⅢ）； 3：7（Eco