实验一：DNA提取.pptVIP

实验一 环境样品总DNA的提取 重要性： 高质量DNA的提取是进行后续实验的基础 高质量DNA的提取是保证所进行的研究能更全面真实反映所研究的环境的微生物区系组成结构的前提。 环境样品： 种类繁多、组成复杂、物理化学性质多变 纯培养的细胞（inoculated bacteria）通常比环境中的原有的细胞（autochthonous bacteria）更容易裂解(Tsai and Olson 1991a; Tsai, Marie J. Park et al. 1991b; Jacobsen 1995) 没有一种方法能适用于所有的环境样品，每一种样品根据其特有的理化和生物学特性，都需要优化出一种特有的提取DNA的方法(Zhou, Bruns et al. 1996)。 本实验室已经建立的方法： Wei, G. F., L. Pan, H. M. Du, J. Y. Chen, and L. P. Zhao. 2004. ERIC-PCR fingerprinting-based community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragments as molecular markers to identify and track populations common to healthy human guts. J. Microbiological Methods. （in press） Gao, P., and L. Zhao. 2002. DNA Extraction from Actived Sludge for Molecular Community Analysis. ACTA ECOLOGICA SINICA 22:2015-2019. Yong, Z., Z. Zhihua, L. Wu, P. Yingjie, and Z. Liping. Simultaneous Recovery of Bacterial and Fungal Community Total DNA from Agricultural Soils. (preparing) DNA提取效率的鉴定： DNA的提取效率，也就是环境样品中有多大比例的微生物的总DNA被提取出来，是提取环境样品DNA的一个重要指标。 显微镜观察计数DNA提取前后的细菌细胞数在一些研究中被用来计算DNA回收效率。(Tsai and Olson 1991a) (Zhou, Bruns et al. 1996) 另一类计算DNA提取效率的方法是在提取DNA的时候加入外源的已知浓度的纯菌或DNA片段。 (Lee, Bollinger et al. 1996) (Mumy and Findlay 2004) 实验材料： 样品的保存： 采集的样品最好立即处理，如不能立即处理，可放在4℃冰箱中保存，为了尽量保证样品中微生物的原貌，保存时间不超过一天。 处理后的样品可以进行总DNA的提取，也可以添加20%的甘油（终浓度）保存于-70℃下。 样品前处理： TENP and PBS TENP buffer： 50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/ml PVP，pH10 PBS buffer： 8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于1L水，pH7.4 PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 样品前处理： 离心收集样品： DNA提取步骤： DNA提取步骤： DNA提取步骤： DNA提取步骤： DNA提取步骤： DNA提取步骤： 裂解细胞： 常用的方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。 对于焦化废水样品：我们的实验结果表明，冻溶、溶菌酶处理、超声波处理对DNA的产量影响不大。 DNA提取步骤： Extraction buffer: Extraction buffer： 100mM Tris，100mM EDTA，200mM NaCl，1% PVP，2% CTAB，pH 8.0 加入Extraction buffer DNA提取步骤： SDS buffer： SDS buffer： 100mM Tris，200mM NaCl，2% SDS，pH 8.0 加入SDS buffer： DNA提取步骤： 酚-氯仿抽提： 主要作用：溶解脂质，并使蛋白质变性，离心后变性蛋白质停留在有机相与水相的交界面，DNA溶解在水相中，通过这种方法可将DNA分离。 作用机理： 酚-氯仿抽提： 吸取速度要慢，减少DNA断裂 尽量不要吸入上层蛋白 DNA提取步骤： 沉淀DNA（异丙醇） DNA可以在乙醇、异丙醇、聚乙二醇（PEG）等