3.细胞生物学2教材课程.ppt

第三章 细胞生物学技术;基本概念： 分辨率（resolution, resolving power)： 是将邻近两点清晰区分辨认的能力。 肉眼的分辩率：0.1～0.2mm 光镜的最大分辨率：0.2?m 电镜的分辨率：0.14～0.2nm;一、光学显微镜 （Light microscope, LM, 简称光镜);简介几种类型显微镜： 普通光学显微镜 相差显微镜 倒置显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜;二、电子显微镜(electron microscope);6;7;细胞化学技术： 是在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，定性或定量分析细胞的显微或超微结构的化学组成及定位。 细胞化学技术类型： 免疫细胞化学(immunocytochemistry) 酶细胞化学(enzyme cytochemistry) 放射自显影(autoradiography);第三节 细胞及其组分的分离 纯化和分析技术;一、流式细胞技术 （Flow Cytometry, FCM);流式细胞计主要由四部分组成：;(3)光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)最为常用。 (4)计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。;流式细胞技术特点：; ?????????????????????????????????????????????????????? ; ;二、细胞分级分离(cell fractionation);细胞分级分离过程必须遵守的几个基本原则： 分离体系所用的溶液必须是等渗的。 分离体系应保持低温，以降低细胞的代谢活动。 无菌操作。;离心是细胞分级分离的重要手段之一 离心的方法： 差速离心法 速度区带离心法 等密度离心;21;差速离心法： 密度均一的介质中 由低速到高速逐级离心，使混合液内的不同大小、形状的颗粒分步沉淀。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 ;速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 ;原理：利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降系数颗粒处于统一梯度层内，达到分离目的。;操作： 在离心管内预装平缓的密度梯度材料：蔗糖或甘油等。待分离样品铺在梯度液顶部，同梯度液一起离心。 细胞或细器在平缓的密度梯度介质中按??自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离的目的。 适合分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。;因沉降速度不同而达到分离的目的 ; 等密度（isopycnic sedimentation）离心： 原理： 在连续梯度的介质中，经足够大离心力和足够长时间则，当pp = pm 颗粒就悬浮于介质中不移动。 常用的梯度液： 蔗糖、甘油、CsCl等。 结果： 离心后，样品按颗粒密度重新分布。;因密度不同而分离;第四节 细 胞 培 养;一、体外细胞培养技术;传代培养（passage culture）：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，产生了具有无限增殖能力的变种细胞，这种细胞能无限传代，称之细胞系。 克隆（clone）：亦称无性繁殖系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。;群体培养（左） 和克隆培养（右） ;目前实验室中常用的几种细胞系;谢谢;35;36;37;Silver Staining;Giemsa;Hematoxylin Eosin Staining;相差显微镜(phase-contrast microscope);相差显微镜与普通光镜的主要区别：是在物镜后装有一块“相差板”，将“相位差”或“光程差”转换成可观察的“振幅差”，结果明暗结构清晰。 可不染色直接观察活细胞，细胞中致密结构，在成像中看起来较深、较黑，细胞呈现立体感。 一般实验室里用的是倒置相差显微镜(inverted phase-contrast microscope);倒置显微镜; ?????????????????????????????????????????????????????????????????????;45;倒置相差显微镜下细胞形态;日本尼康UFX-DX倒置显微镜;荧光显微镜;德国LeicaDMLB荧光显微镜 1997年10月$25,430;50;绿色荧光蛋白(green fluorescent protein， GFP );免疫荧光染色;细胞核;54;Two ways of amplifying an oncogene (m