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真菌HOG1及PBS2基因功能验证 摘要：本实验pRS-AtHOG1-166质粒、pRS-AtPBS2-466质粒DPRE质粒转化酵母hog1基因缺失突变菌株Uva17及pbs2基因缺失突变菌株Uva18，通过计算转化率来得知转化的结果及效率。 关键词：酵母质粒；YEPD培养基；提取；酶切 HOG途径参与诱导胁迫反应基因的表达、细胞形态恢复、信息素反应途径的阻遏及致病性等过程.Hoglp和Pbs2p蛋白激酶在细胞壁结构完整性、孢子分化、菌丝形成和浸入生长以及高渗透压甘油形成过程中起到重要作用.本研究通过运用基于λ噬菌体特异位点重组反应Gateway 系统构建极细链格孢菌Alternaria tenuissimacDNA表达文库.通过遗传手段，筛选获得了极细链格孢菌AtenuissimaAtHOG1及AtPBS2基因,并研究了AtHOG1及AtPBS2基因的功能，建立了以抗性基因作为选择标记的技术体系。 1.主要试剂、酶、菌株 酵母质粒提取试剂盒（100次）、细菌质粒小提取试剂盒（100次）；ssDNA、Nitrogen Base without amino acids,YNB)及各种氨基酸；BsrGⅠ酶，DNA Marker分子量为15000bp一管，2000bp一管；酿酒酵母hog1基因缺失突变菌株Uva17及pbs2基因缺失突变菌株Uva18；pRS-AtHOG1-166阴性菌株（E.coli）。 主要实验仪器及耗材 0.22nm一次性过滤器（40个）、50ml的一次性注射器（40个）、蓝、黄、白枪头各一盒/组、250ml三角瓶5个/组、1.5离心管若干、带盖50ml离心管2个/组、90mm培养皿20套/组。 超净实验工作台、高速离心机、微量加样器、凝胶成像系统、紫外分光光度计、水平电泳仪。 2实验方法 2.1 培养基配制 YEPD培养基200ml/组；SD-URA培养基200ml/组；10倍氨基酸混合液无尿嘧啶液。 表1 YEPD培养基配方表 酵母提取物（Yesat extract） 10g 0.5g 胰蛋白胨(Peptone) 20g 1g 葡萄糖（Glucose） 20g 1g 琼脂粉 20g 1g 超纯水定容至 1000ml 50ml 调整pH值至7.0,15psi(1.05kg/cm2)高压，蒸汽灭菌20分钟，温室备用。 表2 SD-URA培养基配方表 无氨基酸酵母氮源（YNB） 6.7g 0.67g 10倍氨基酸混合液无尿嘧啶（无URA） 100ml 10ml 葡萄糖（Glucose） 20g 2g 琼脂粉 20g 2g 超纯水定容至 1000ml 100ml 调整pH值至7.0,15psi(1.05kg/cm2)高压，蒸汽灭菌20分钟，温室备用。 表3 YEPD+1MNacl培养基配方表 酵母提取物（Yesat extract） 2g 胰蛋白胨(Peptone) 4g 葡萄糖（Glucose） 4g 琼脂粉 4g NaCl 11.7g 超纯水定容至 200ml 表4 10倍氨基酸混合液配方表 硫酸腺嘌呤（Adeninesulfate） 200mg L-精氨酸盐酸盐（L-argjinie-hcl） 200mg L-组氨酸盐酸盐（L-histidine-hcl） 200mg L-异亮氨酸(L-isoleucine) 300mg L-亮氨酸(L-leucine) 1g L-赖氨酸盐酸盐（L-lysine-hcl） 300mg L-蛋氨酸（L-methionine） 200mg L-苯丙氨酸（L-phentlalanine） 500mg 苏氨酸（Threonine） 2g L-色氨酸（L-thrptophan） 400mg L-酪氨酸（L-tyrosine） 300mg L-缬氨酸（L-valine） 1.5g 超纯水定容至 1000ml 0.22um滤器过滤除菌，-20℃保存备用 2.2 pRS-AtHOG1-166质粒、pRS-AtPBS2-466质粒DPRE质粒的提取 步骤： （1）3ml培养过夜菌液12000rpm温室离心一分钟，收集菌体； （2）弃上清，把沉淀完全悬浮于250ul溶液Ⅰ（已经加入RNaseA）中； （3）加入250ul溶液Ⅱ，温室下轻轻颠倒混匀7～10次，至菌液透明，温室放置2min； （4）加入350ul溶液Ⅲ，温室下轻轻上下颠倒混匀7～10次至白色沉淀出现； （5）12000rpm,温室，离心10min，将上清液加入一个新的DNA纯化柱中，温室放置1～2min; （6）12000rpm,温室，离心1min，倒掉收集管的废液； （7）加入500ul溶液PB（已加入无水乙醇），12000rpm,温室，离心30秒，倒掉收集管中的