Strobilurin类杀菌剂醚菌酯和肟菌酯的作用机制检测方法研究及其在柑橘中的残留规律.doc

Strobilurin类杀菌剂醚菌酯和肟菌酯的作用机制、检测方法研究及其在柑橘中的残留规律 50 13.22 ,66.92,273.74 μg/mL 和 0.18,0.32 ,1.37 μg/mL 。将三种真 菌于 EC 50 浓度 水平的含醚菌酯和肟菌酯 培养基中培养, 菌丝蛋白含量 为检测目标,青霉菌 和绿 霉菌可溶性蛋白含量分别从 3h 和 1h 后降低并持续至 24h, 炭疽菌可溶性蛋 白含量从开始下降到再次上升只维持了 3h,此后则逐渐升高; 当培养基中同时含 有旁路氧化 酶抑制剂 SHAM 时,醚菌酯和肟菌酯 抑制三种病原真菌的 EC 浓度 50 水平 明显 下 降, 各 菌 丝体 可 溶 性 蛋 白总 水 平 也明 显 降 低 。 结果 表 明 ,醚 菌 酯 和 肟 菌 酯 能 较 好 地 抑 制 三 种 病 原 真 菌 生长,SHAM 与两种杀菌剂 均 有 协 同 作用 效 果。 采用差速离心法获得真菌线粒体, 分别 研究 0.2-200μg/mL 的醚菌酯 和肟菌 酯对 真 菌 线 粒体 内 膜 上四 种 酶 复合 体活 性 的 影响 。 结 果 表明, 两 者 对复 合 体的 活 性 影 响 趋 同, 四 种 复合 体 活 性 的 抑制 率 与 药剂 浓 度 成 正 相关 ,但 各处 理 浓 度 下 的 复 合 体 Ⅰ、 Ⅱ 、 Ⅳ受 抑 制 程 度 均不 如 复 合体 Ⅲ ; 相 同 浓度 处 理 下, 醚 菌 酯 和 肟 菌 酯 对 青霉 菌 和 绿 霉 菌 中 的 复 合体 Ⅲ 抑 制程 度 较 炭 疽 菌的 大 。 醚菌 酯 和 肟 菌酯可通过 影响线粒体呼吸链 酶复合体活性 而抑制真菌的生长。 2.醚菌酯和肟菌酯 QuEchERS-HPLC 同步检测 方法的建立 以 AOAC 认可 的 QuEchERS 法为基础,样品采用含 1% 乙酸的乙腈 溶液, 通过优化吸附剂确定采用 PSA:C184:1/m:m 作为最佳前处理条件。 同步检测 采 I 用 210 nm 的波长, 甲醇: 水(80:20)为流动相洗脱 ,醚菌酯和肟菌酯的保留时 间 分别为 9.3 min 和 12.3 min。当加标浓度为 1.0,0.5,0.05 mg/kg 时,橘肉和 橘皮中醚菌酯的平均回收率约为 83.93%~95.50% 和 80.08%~93.77% ,相对标准 偏差 RSD% 分别为 1.55%~4.50% 和 1.80%~4.24% ; 肟 菌 酯 的 平 均 回 收 率 约 为 80.84%~93.47% 和 80.00%~91.00% ,相对标准 偏差 RSD% 分别为 3.00%~4.20% , 1.40%~5.20% 。醚菌酯 和肟菌酯的最低检出浓度分别为 0.005 和 0.008 mg/kg , 符合农残分析 的国际标准要求 。 3.醚菌酯和肟菌酯 ELISA 检测方法的建立 1 ) 将 含 醚 菌 酯 和 肟 菌 酯 共 有 活 性 基 团 的E-22- 溴甲基苯基-2- 甲 氧 亚 氨 基乙酸甲酯 (OEBr ) 与 巯基丙酸反应获得羧基, 以其为连接臂, 采用 活化酯法、 混 合 酸 酐 法 分别 制 备 免疫 原 和 包 被 原, 反 应 产物 分 别 利 用 紫外 吸 收 扫描 与 结 合 比的测定、红 外、质谱 、 核磁、SDS方 法进行鉴定表 明 ,免疫 原和包被 原合成成功,其中免疫原的结合比为 12.8:1 ,达到动物免疫的要求 。 2 )免疫原与弗氏佐剂充分乳化制备疫苗,采用多点皮下、腿部肌肉免疫 3 只新西兰大白兔, 为期 3 个月。 当 3 只兔子的抗血清效价分别为 64000 ,32000, 32000 且不再上升时, 采用效价最高的抗血清进行下一步实验。 3 )以包被原 Hapten-OVA 和获得的最高效价 抗体Ab 建立 IC-ELISA 法。 该方法对通用半抗原的 IC 为 9.5μg/mL, IC 为 0.005μg/mL ;抗体 对醚菌 酯 和 50 10 肟菌 酯 有 较 好 的 特 异 性 和 灵 敏 性 ,IC 分别为 15.3 ,19.6 μg/mL, IC 分别为 50 10 0.0074 ,0.011 μg/mL ; 但对唑菌铵酯的交叉反应率小于 0.1% 。结果表明该方法 可作为醚菌酯和肟菌酯的酶联免疫分析使用。 4 )采用建立的 IC-ELISA 检测柑橘样品中醚菌酯和肟菌酯 ,检测结果表明 当加标浓度为 100 ,10,1 μg/mL 时,醚菌酯 回收率分别为 104.35% ,95.57% , 82.73% ,RSD% 分别 为 11.1% ,10.8% ,8.8% ;肟菌