兽医免疫学实验ELISA .ppt

* 实验四 酶联免疫吸附试验 Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） 本次实验内容： 间接ELISA检测禽流感病毒（AIV）抗体 目的：掌握间接ELISA原理，操作方法及结果判定方法 原理：简单地说是利用抗原-抗体反应的高度特异性和酶反应的高度敏感性，进行对抗原或抗体的检测，是一种定性或定量的综合性技术。 包被鸡抗NP蛋白IgG IBV 加IBV或被检 加兔抗IBVIgG 加羊抗兔IgG-HRP 加底物显色 加终止液 双抗体夹心ELISA检测传染性支气管炎病毒（IBV ） 加底物显色 加被检血清 加羊抗鸡IgG-HRP 加终止液 间接ELISA检测禽流感病毒抗体（AIV ） 包被AIV NP蛋白 1、酶标板 2. 禽流感病毒 NP蛋白 3、酶标记羊抗鸡IgG（ IgG-HRP ） 4、阳性对照：AIV抗体 5、阴性对照：健康鸡血清稀释液 6、被检材料 7、空白对照（PBS） 实验材料： 8、包被液 9、洗涤液 10、封闭液：0.5%牛血清白蛋白（BSA） 11、底物液 12、终止液：（2M H2SO4） 13、微量加样器（50ul） 14、酶联免疫吸附测定仪 1、包被AIV-NP蛋白：用微量加样器吸取稀释好NP蛋白加入ELISA 板孔内,100 ul/孔，置37℃，1h后取出放4℃冰箱,或直接放入4℃冰箱 2、洗涤:次日从冰箱中取出滴定板,甩干内容物,向孔内加入(原则上以不溢出孔为益,用塑料吸管)洗涤液,静置3分钟,甩干,并将板孔朝下放再滤纸上反复拍打干净,再加洗涤液,如此洗3次,每次3分钟 3、封闭：加0.5%BSA，100 ul/孔，37℃，30分钟，取出后甩干 4、加被检样品：100 ul/孔，同时设阳性、阴性、空白（PBS）对照。均为100 ul/孔 实验步骤： 5、洗涤：同3 6、加羊抗鸡IgG－HRP ,100 ul/孔，37℃，30分 钟，取出后甩干 7、洗涤：同2 8、加底物液：100ul/孔，置37℃，放置15分钟 10、终止反应：每孔加终止液50ul，室温5分钟，终 止反应。 *