实验三Lowry法测蛋白浓度-吴旭日.pptVIP

实验三 酪蛋白含量测定——Folin-酚试剂法(Lowry法) 一 目的要求 学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。 进一步掌握分光光度法。 二 实验原理（一） 蛋白质定量检测方法 凯氏定氮法（Kjeldahl determination） 双缩脲法（Biuret method） Folin－酚试剂法（Folin-phenol Reagent Method） 紫外吸收法（UV spectrophotometry） 考马斯亮蓝法（Coomassie brilliant blue staining） BCA法（Bicinchoninine acid assay） 1 凯氏定氮法（Kjeldahl determination） 样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品的氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1)2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3)?　 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。计算所得结果为样品总氮量。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25。 ? ?? 2 双缩脲法（Biuret method） 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。 当底物中含有肽键时（多肽），铜离子与肽键配位，配合物呈紫色。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。 可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为0.5-10 mg/ml。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。干扰这一测定的物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此此法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 2 双缩脲法（Biuret method） 3 考马斯亮兰法（Bradford法） 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。 配置方法：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50 m1 95%乙醇，加入100 ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200 ml即可。 考马斯亮兰G-250在酸性溶液中主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。 该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为25～200μg/mL，最小可测2.5 μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 干扰因素较少，氨基酸、肽、EDTA、Tris、糖等对其无干扰。 主要的干扰物质有：去污剂、?Triton?X-100、SDS和0.1 N 的NaOH。 3 考马斯亮兰法（Bradford法） 4 紫外吸收法（UV spectrophotometry）  蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280 nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。利用该正比关系，即可测定蛋白质的浓度。 本法对于测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质误差较大，故适用于测定与标准蛋白质酪氨酸、色氨酸这类氨基酸含量相仿的样品。 由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH变化而改变，故应用此法时要注意溶液的