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实验六 定磷法测核酸浓度
实验六 定磷法测定核酸浓度 实验内容 标准磷溶液定磷曲线的制作； RNA消化； 测定RNA消化液总磷含量； 计算RNA溶液中RNA的浓度。 * * 1.学习掌握钼蓝法测定磷含量的原理和方法。 2.学习掌握核酸中有机磷的消化和测定，并由此计算核酸的量。 钼蓝法比色定磷的原理 1）钼蓝显色剂+ 无机磷 钼蓝复合物 2）在一定范围内，蓝色的深浅和磷的量成正比,可用比色法测定 实验原理 1、标准曲线（定磷曲线）的用途 3 1.6 1.4 6 3 1.0 2.0 8 3 3 3 3 3 3 定磷试剂/mL 1.4 1.8 2.0 2.2 2.6 3 H2O/mL 1.6 1.2 1.0 0.8 0.4 0 标准磷溶液/mL 7 5 4 3 2 1 管号 步骤 反应条件： 45℃，25min 660nm测定吸收值 磷含量（μg） A660nm RNA消化的目的？ 为什么将原液消化算回收率？ 总磷 无机磷 RNA磷 测定值 DNA磷 消化回收率 根据标准磷原液计算回收率 直接用钼蓝法进行测定 由总磷量和无机磷量计算可得 核酸 试剂与器材 1. 钼蓝显色剂 2. 标准磷试剂、标准磷原液 3. 分光光度计 4. 烧杯、搅拌棒、滴管、容量瓶 5. 凯氏烧瓶 6. 试管 7. 水浴锅 * 本实验配置试剂所用的水指的是蒸馏水 三、试剂和器材 四、操作步骤 1）标准曲线样品的准备（4组同学，测三条标准曲线） 2）无机磷的测定（另外一组同学做总磷测定和无机磷测定） A660nm 3.0 3.0 3.0 定磷试剂 0 0 3.0 蒸馏水 3.0 3.0 － RNA样品/ml 2 1 0 试剂 3）反应条件： 45℃，25min 3 1.6 1.4 6 3 1.0 2.0 8 3 3 3 3 3 3 定磷试剂/mL 1.4 1.8 2.0 2.2 2.6 3 H2O/mL 1.6 1.2 1.0 0.8 0.4 0 标准磷溶液/mL 7 5 4 3 2 1 管号 步骤 滤纸过滤 3）总磷样品的准备（八人一组） 100 100 100 100 100 用水定容/mL 沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却 1 1 1 1 1 H2O/mL 168-200℃继续消化至溶液透明，冷却 2 2 2 2 2 30％H2O2（滴） 168-200℃消化30min，溶液呈黄褐色，冷却 4 4 4 4 4 10mol/L H2SO4/mL - - - - 1 H2O/mL 2 2 - - - 标准磷原液/mL - - 2 2 - RNA/mL 4 3 2 1 0 管号 步骤 显色方法P19
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