[农学]5-7PCR技术DW.ppt

常用分子生物学及软件下载网址 /soft/class1 / /index.asp /entrez/ DNAsis DNAstar Vector NT 参考书 1.分子克隆-实验指南(第二版)，第14章 2.分子克隆-实验指南(第三版)，第8章 3. PCR最新技术原理、方法及应用。黄留玉主编，化学工业出版社，2005年 4.靶向新基因的分子克隆策略-理论与方法。张学敏主编。军事医学科学出版社 DNA的结构 5′······ATGGTCCGTAAATGCTGCATG ·····3′ 3′······TACCAGGCATTTACGACGTAC ····· 5′ 方响性：5′ 3′ DNA的双螺旋结构 三篇重要论文 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，即利用DNA聚合酶通过引物延伸DNA的某个特定的区域而进行的重复双向DNA合成。其过程共包括模板DNA变性、退火和延伸三个步骤。每一循环的产物可作为下一个循环的模板, 这三步周而复始地循环进行使被扩增的DNA片段的量呈指数级增加。这样经过的一定数量的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。利用这一技术可以很容易将一段基因复制为原来的十亿甚至一千亿倍。 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 1). 变性(?Denaturation)：将DNA加热变性，?使双链DNA加热后变成单链DNA以便它与引物结合作为复制的模板。一般加热到92—96℃使DNA变性，变性DNA所需要的时间决定于DNA的复杂性、反应管的导热性能、PCR仪的种类和反应的体积。对于G十C含量高的DNA序列，加入甘油、DMSO、延长变性时间可以提高PCR产量。在多数情况下，94℃、30秒即可达到有效变性。 2).?退火(Anneal)?：?Primers在一定的温度下与变性模板DNA的互补序列配对结合。这一步的温度从37℃到72℃都有，由引物的长度和碱基组成及与靶序列的同源性程度而定。引物以显著大于靶序列的浓度存在，长度也短于靶序列，因而它们与互补序列的配对速度比靶序列重新配对成双链的速度快几个数量级 PCR的要素：参加PCR反应的物质有五种引物、 模板、dNTP、DNA聚合酶和反应缓冲液 １.?引物：是与扩增DNA片段两端序列互补的一对寡核苷酸片段。引物的使用浓度0.2uM～0.5uM，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 2. DNA模板?(Template): 模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA反转录得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌培养液、菌落或噬菌斑等。 PCR的要素 3.? DNA聚合酶：是一类耐热的DNA聚合酶。至今应用最多的是Taq DNA聚合酶。目前有多种类的酶供应，如Vent,Pfu等。根据循环圈数、DNA片段扩增长度，催化一总反应体积为50ul的PCR反应所需的酶量为1 ～ 2μ。浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则PCR产量减少。 4. 合成的原料dNTP：在PCR反应中，dNTP的使用浓度一般为50～200umol/L，4种dNTP的浓度相等( 等摩尔配制)。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。 PCR的要素 5.反应缓冲液：为Tris-HCl缓冲液，依不同的DNA聚合酶种类，pH值在7.5-9.0之间，含有Mg2+、K+等离子、BSA和Tween等去污剂。一般以10×浓度提供。其中Mg2+的浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。有些厂商提供的反应缓冲液中不含Mg2+而单独提供含Mg2+的溶液