[医药]2008《中国口腔医学年鉴》.docVIP

腺病毒及腺病毒相关病毒介导正常小型猪腮腺基因转导表达特性研究 作者：颜 兴 导师：王松灵 单位：首都医科大学附属北京口腔医院涎腺疾病中心及基因治疗和牙齿再生分子生物 学实验室 论文摘要 涎腺的解剖与生理学特点适合作为基因疗法的靶器官。利用基因转导技术通过涎腺投递治疗基因，具有潜在的治疗涎腺本身疾病、口腔和上消化道疾病以及治疗全身系统性疾病的临床前景。涎腺基因疗法是将携带外载经导递细达因所编码的质补偿疗Ad5）介导人类促红细胞生成素（hEPO）和生长激素（hGH）的基因转导小型猪腮腺，以研究不同分泌途径蛋白质的表达特点与分泌机制。小型猪9只，分3组；第一组经腮腺导管逆行注射AdCMVhEPO、第二组注射AdCMVhGH，剂量1011 v.p /侧，第三组对照。按转导后3、7、14天时间点取血清、唾液标本，检测转基因蛋白浓度；14天取腮腺与脏器组织标本，做QPCR与HE染色。第二部分比较分别携带CMV、EF1α、LTREF1α三种不同启动子的腺病毒，转导小型猪腮腺的表达效果。小型猪4组，每组3只，分别双侧转导AdCMVhEPO、AdEF1αhEPO、AdLTR2EF1αhEPO，一组对照。按时间点3、7、14、28、60、90天采集血液与唾液样本，观察转基因hEPO的表达及血液学变化。第三部分应用不同的载体投递量，检测转基因蛋白的表达与载体的生理学效应，选择最佳载体投递量。应用AdLTR2EF1αhEPO，分别采用1011 v.p、1010 v.p、109 v.p各投递至3组共9只小型猪腮腺，按时间点3、7、14、28、60、90天采集血液与唾液样本，观察转基因hEPO的表达及血液学变化。第四部分研究观察2型腺病毒相关病毒介导外源基因hEPO（AAVhEPO）转导小型猪腮腺的长期表达情况，比较AAV与Ad在小型猪腮腺基因转导中的差异。材料与方法：小型猪6只，分两组。实验组双侧转导AAVhEPO各1011 v.p，按时间点2、4、6、8、10、12AdLTR2EF1α转导效率最好，三组载体对血液学指标与组织学影响轻微。第三部分实验1011 v.p与1010 v.p组血液中有hEPO表达，HCT值升高，109 v.p组血液未见表达。血常规与血生化有轻度改变，呈现剂量正相关性。转导后90天组织学检查无异常。第四部分实验AAV2介导hEPO转导后，血液转基因EPO表达于8周达到峰值，可维持至12周及更长，致小型猪血液HCT值升高达16%；AAV2对血常规与血生化指标影响轻微，4周恢复至转导前水平；对腮腺及脏器无病理学损害。 结论：转基因hEPO可分泌入血，产生生物学效应；hGH分泌入唾液；AD5载体用于腮腺基因转导安全有效。启动子为杂合逆转录病毒的AdLTR2EF1α载体比EF1α与CMV启动子的常规腺病毒载体，表现出更高的转基因水平，转基因蛋白的分泌总量更多、持续分泌时间延长。就转基因hEPO的生物学效应与载体影响而言，AdLTR2EF1αhEPO投递量为1010 v.p更加合理。Ad与AAV载体介导hEPO转导小型猪腮腺，转基因蛋白表达可分泌入血液，产生生物学效应。转基因蛋白血液唾液的分布规律与啮齿类动物不同，AAV可长期介导基因在涎腺中长期表达，是可用于涎腺基因转导的较理想有效载体。本研究应用与人类涎腺相似的小型猪动物模型选择人促红细胞生成素（hEPO）及人生长激素（hGH）为目的基因，应用5型腺病毒（Ad5）与2型腺病毒相关病毒（AAV2）为载体介导进行腮腺研究 1．．3．不同启动子介导的Ad载体在腮腺基因转导中的表达效率不同。杂合逆转录病毒MoMLV启动子的Ad载体比EF1α与CMV启动子的常规Ad5载体表现出更高的转基因表达水平。 4．．AAV2介导hEPO在大型动物模型中转基因成功。转基因蛋白hEPO表达强度较Ad5转导后表达水平低，但可在血液与唾液中稳定表达超过12周，同时产生生物学功效。 关键词：基因转导 腺病毒 腺病毒相关病毒 腮腺 小型猪 促红细胞生成素 通讯地址：北京市崇文区天坛西里4号首都医科大学附属北京口腔医院涎腺疾病中心及基因治疗和牙齿再生分子生物学实验室 邮编：100050 电话：010电子邮箱：slwang@ccmu.edu.cn