GST酶亲和层析及SDS-PAGE.ppt

工程菌中GST酶的亲和层析分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）鉴定 Contents 根据蛋白分子特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。 性 质 方 法 分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀 电荷 电泳、离子交换层析 吸附性质 吸附层析(羟基磷灰石层析、疏水作用层析) 对配体分子 亲和层析 的生物亲和力 蛋白质分离纯化 （1）盐析(Salting-out) 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[(NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl 等]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。常用的盐析剂是硫酸铵，其盐析能力强，水中溶解度大，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。 盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。 （2）透析(Dialysis) 蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常选用透析法或凝胶过滤。 （3）等电点沉淀 蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 (4)有机溶剂法 与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 有机溶剂引起蛋白质变性的原因有二： 降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。 极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。 室温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。可在不断搅拌下将预冷的有机溶剂逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同蛋白质。 二、细分级分离 一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。 常用柱层析方法：分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。 常用电泳方法：PAGE、等电聚焦电泳(IEF)。 另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。 细菌中外源GST酶的分离纯化及鉴定 1、细菌中外源GST蛋白的诱导表达(IPTG诱导) 2、细菌的裂解（溶菌酶法） 3、 Glu-Aragrose beads亲和层析分离GST蛋白 4、GST蛋白的SDS纯度鉴定 亲和层析的原理 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。配基必须偶联于不溶性母体(matrix) (又称载体或担体)上，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。 当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常在载体和配基之间接入不同长度的连接臂(space arm)。 GST酶的亲和层析 操作步骤 一、细菌诱导培养 ⑴ 取一支冻存的B菌，无菌条件下解冻后取20μl放入20ml含氨苄青霉素（Amp，100 ug/ml）的培养液中，培养过夜。 ⑵ 取培养12~14h后的小量培养菌液2ml放入250ml 含Amp的LB培养液中扩大培养3~5h后至OD600为0.6~0.8，加入1M IPTG 250μl诱导培养3~6h后，收集菌液。 ⑶ 将菌液每3-4ml/管收集在Ep管中，离心后弃上清。 二、 GST酶纯化 ⑴ 在含细菌沉淀的Ep管中加入500 μl 的裂解液悬浮细菌，再加入 50 μl 溶菌酶溶液，反复在手中颠倒振摇30 min，直至管内液体变得清亮，10000g, 离心5min后收集上清。（留存10μl上清于一新Ep管