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核酸和蛋白质分析技术 第一节 核酸分析技术 讲述内容： 1、核酸电泳 2、杂交技术 3、PCR技术 4、基因芯片 一、核 酸 电 泳 （一）DNA的凝胶电泳 凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于核苷酸多态性的分析 琼脂糖凝胶电泳的基本过程 材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。 基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果 注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： 1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液 特殊的凝胶电泳 倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分离分子量10～2000kb的DNA分子； 钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可分离大于107bp的DNA分子 （二）RNA 电 泳 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 二 核酸杂交技术 （一）Southern Blot 原理： （二）Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 （三）探针标记技术 1 标记物：放射性和非放射性两种 放射性： 非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 2、标记方法 （1）切口平移法 （2）随机引物法 （3）末端标记法 （4）单链DNA探针标记 （5）寡核苷酸探针标记法 三 PCR技术 PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖； pfu DNA 聚合酶 耐热 5’?3’DNA聚合酶活性 3’→5’外切酶活性 精确度：pfu Taq 但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果 （三）PCR技术的应用 1. 基因检测： 2. 基因克隆化 3. DNA突变 4. DNA序列分析 四、基因芯片 利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究 操作流程 （1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）； （2）靶基因样品的制备； 靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组） 标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5 （3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似 封闭 预杂交 杂交 洗脱 （4）杂交信号的检测与结果的分析 激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析 基因芯片的应用 用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究 举例：美国斯坦福大学Davis等用PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库中得到了1046种cDNA片段，制成芯片，然后与热处理的T淋巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证实，其中3个是未报导的新基因。 第二节 蛋白质分析技术 讲述内容： 一、Wester