3.细胞生物学技术方法--光电镜技术方法.pptVIP

第三章;一、显微镜技术 二、细胞的分离和培养 三、细胞组分的分级分离 四、细胞内分子的示踪 五、分子生物学实验技术;显微镜技术;光学显微镜;1.普通光学显微镜;普 通 双 筒 显 微 镜; 显微镜分辨率计算：;(2)最大放大倍数;(3)光学显微镜总放大倍数 物镜放大倍数 × 目镜放大倍数;标 本 制 备;第二步.脱水 第三步.包埋（embed） 目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。 第四步.切片（section） 目的：切成薄片，便于切片黏附在载 玻片上进行染色。 仪器：切片机 切片厚度：1～10 ?m ;第五步.染色（staining） 目的：使细胞成为可见. 方法： A.选择性染色 苏木精－细胞内核酸的分布 伊 红－细胞质染色 ;B.特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体;;2.荧 光 显 微 镜;原理: 荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波 长的短波光线，并发射出比原来吸收波长 更长的光。;;荧光的观察;;;图示： 鼠主动脉 平滑肌的 荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red ;;免疫荧光显微镜技术（Immunofluorescence microscopy）;;;绿色荧光蛋白green fluorescent protein GFP;;载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察 待定蛋白质在细胞内的位置分布 ;;;观察过氧化物酶体;3.直视活细胞的相差显微镜; ⑵相差显微镜 细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种“相位差”变成“振幅差”，即 图像的明暗差。;通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快;;; ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ;4.观察物体轮廓的暗视野显微镜;原理: 利用特殊装 置使照射光斜照到 样品上，照射光无 法进入物镜，故呈 暗视野。只有从样 品发出的散射光才 能进入物镜被放??, 在暗的背景中呈现 明亮的像。;分辨率： 典型的动物细胞 ——— 10～20 ?m 一般的细菌和线粒体—— 0.5?m (500nm) 普通显微镜 ———— 0.2μm(200nm) 暗视野显微镜———— 0.004-0.2μm(4-200nm) 应用： 能观察物体轮廓,分不清内部的微细结构。 用以观察活细胞内的细胞核、线粒体, 以及 液体介质中的细菌等微粒的运动 。;;5.显微电影摄影 —记录细胞或细胞器运动过程和速度;;6.共聚焦激光扫描显微镜;; 激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台 上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像 计算机图像三维重组获样品立体图像;分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，约是普通光镜的3倍。 应用： 观察细胞形态 统计光密度来定量细胞内成分 三维重建;;;1.透射电子显微镜 2.扫描电子显微镜 3.透射电镜增大 反差的方法;1.透射电子显微镜;;;;透射电镜;透射电镜的成像原理;透射电镜生物标本制备过程;脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本不能含水。梯度乙醇。 包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细胞的1/200厚度。 染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染色。重金属浸染。;;;电镜三维重建技术;2.扫