LAMP,BDNA,NASBA技术原理与应用比较.ppt

bDNA,NASBA,LAMP技术原理与应用比较 北京蓝谱生物科技有限公司 ——日本荣研指定中国LAMP技术推广者 核酸检测技术 变温检测技术 PCR (polymerase chain reaction) LCR(ligase amplification reaction) Real-time PCR 等温检测技术 ——LAMP等 核酸等温检测技术 信号的放大 　　bDNA (branched DNA) 模板的扩增 TAS(Transcription-Based Amplification Systems) ３ＳＲ(self-sustained sequence replication) ＮＡＳＢＡ(nucleic acid sequence-based amplification) ＳＤＡ(strand displacement amplification) ＬＡＭＰ(loop-mediated isothermal amplification) 一、bDNA技术原理与应用 bDNA的合成 bDNA检测应用 bDNA检测技术特征 ５条探针，其中只有两条目标探针要设计，其它探针都可以模块化。 目标检测片段不会进行数量扩增。 样本处理十分简单，不需要纯化ＤＮＡ。 避免了扩增产物的污染问题。 避免了ＰＣＲ抑制因素可能带来的假阴性问题。 试剂无需冷藏保存。 采用仪器或照相机检测化学发光。 可高通量进行检测不同病原体。 二、NASBA技术原理与应用 NASBA检测应用 NASBA检测技术特征 使用反转录酶,RNA酶H,T7RNA聚合酶进行循环反应. 上游引物带有Ｔ７RNA聚合酶结合位点，下游引物带有ＥＣＬ检测核苷酸序列，此外，还有一条俘获探针用于固定扩增产物． 扩增产物是单链ＲＮＡ，后续操作较复杂． 连续等温反应,特殊仪器进行检测, 特异性强，灵敏度高，但成本也非常高昂． 可与分子信标探针联合使用，进行单管实时荧光检测． LAMP技术原理与应用 LAMP引物设计原则 引物间的距离 F2与B2之间的碱基数约为120-180个,F2与F3或者B2与B3间的碱基数为20个以内,F2与F1或者B2与B1之间碱基数为40~60个，B1与F1之间可以没有碱基间隔。 引物的Tm值 正常情况下或者富含GC区域为60-65度，富含AT区域为55-60度。 引物末端的稳定性 F1C与B1C的5’端，F2/B2，F3/B3的3’端6个碱基的dG值要小于-4kal/mol. GC含量与二级结构 GC含量约40-60%。尽量避免二级结构的产生，尤其是3’端。 其它事项 在目标区域引物以外的序列中存在的限制性内切酶位点，可以用来确认扩增产物。 常用反应体系 FIP,BIP: 40pmol F3,B3: 5pmol loopF,B: 20pmol dNTP: 1.4mM Betaine: 0.8M Tween20: 0.1% (NH4)2SO4: 10mM MgSO4: 8mM KcL: 10mM Tris-Hcl(pH8.8): 20mM Bst : 8U Loop引物的引入有助于提高灵敏度，缩短反应时间 LAMP扩增产物电泳分析 LAMP结果分析——浊度 LAMP结果分析——荧光 LAMP结果分析 LAMP检测法特征 LAMP检测法特征 检测是连续等温进行的。 扩增效率十分高，反应灵敏。 采用4条引物，识别6个位点，特异性强。 不需要特殊的试剂与仪器，总费用很低。 反应不需要开盖，在一管内完成全部检测。 利用Bst酶的链置换功能进行反应。 加入反转录酶，可以完成ＲＮＡ的一步法检测。 LAMP方法与其他基因扩增法的比较 LAMP检测法总结 谢谢大家 北京蓝谱生物科技有限公司 ——LAMP研究者的家 *BJLP BJLP * Detection of Trypanosoma brucei spp. in Human Blood by a Nonradioactive Branched DNA-Based Technique 5’ 3’ B3 B2 B1 F1C F2C F3C LAMP引物位置与命名 FIP=F1C+TTTT+F2 BIP=B1C+TTTT+B2 B3 F3 (Loop F, Loop B) 引物Ｔm值的选择 F3,B3F2,B2F1,B1