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Western blot 实验技术 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 蛋白样品的制备 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 凝胶成份 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 ?? SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED（加速剂） 过硫酸铵(时间) （催化剂） Tris-甘氨酸电泳缓冲液 各主要成分作用 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择tris－HCL系统 TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固； 十二烷基硫酸钠（SDS）：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠 凝胶浓度与蛋白分离范围 10%分离胶的配制 水 3.125ml 凝胶溶液 2.5ml 分离胶缓冲液 1.875ml AP试剂 100ul TEMED试剂 10ul 浓缩胶的配制 水 1.53ml 凝胶溶液 0.33ml 浓缩胶缓冲液 0.63ml AP试剂 50ul TEMED试剂 5ul 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。 转膜后检测 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。 封闭 脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 把PVDF放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 * * 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 SDS： 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。 蛋白质-SDS胶束的特点： （1）具有相同的形状，形状像 一个长椭圆棒（2）平均1 g 蛋白质结合1.4 g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚基- SDS胶束基本上是相同的。 （4）长轴的长度则与亚基分子 量的大小成正比 57-212 5.0 36-94 7.5 16-68 10 12-43 15 线性分离范围（KD) 凝胶浓度（％） 转膜 半干式转膜 注意： 转移单元无气泡 注意方向 戴手套，防止引入污染蛋白 胶、膜大小一致，半干转注意短路。 膜、滤纸要先平衡 20%甲醇改善电转移效果。 转移效果： Ponceau-S Red 固相支持物的选择： 硝酸纤维素膜（nitrocellulose, NC) NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅； 价格低廉，使用方便。 结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。 Polyvinylidene fluoride (PVDF) 与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 一抗、