病理方面的染色技术，HE染色，IHC，FISH.pptVIP

病理方面的染色技术 Yinsai 技术部 广州伯信生物科技有限公司 主要内容 HE染色 免疫组化（IHE） 荧光原位杂交（FISH） HE染色 苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ，HE) 石蜡切片技术里常用的染色法之一 。 HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。 HE染色原理 脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。 伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染成红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。 苏木精 细胞核 蓝色 伊红 细胞质和细胞外基质 红色 石蜡切片的HE染色流程 HE染色图片 HE染色图片 免疫组织化学 （Immunohistochemistry,IHE） 概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 抗原（antigen） 定义： 是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。 抗原具有两种性能： （1）免疫原性（immunogenicity）指抗原分子具 有诱导机体产生免疫应答的特性。 （2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗 体或效应T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应 的特性。 抗体（antibody） 定义： 机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。 抗体主要存在于血清内 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM 免疫组化的特点 特异性强 敏感度高 定位准确 免疫组化的分类 按标记物质的种类 免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等 按染色步骤 直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法） 按结合方式 1、抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法 2、亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等 3、聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 直接法： 间接法： 样本 实验所用主要分为两大类： 石蜡切片（用得最多） 组织标本 冰冻切片 组织印片 细胞标本 细胞爬片 细胞涂片 抗原修复 因为常规的石蜡切片标本常用甲醛或多聚甲醛固定，结果使得： -抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇； -蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 所以在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 福尔马林固定和抗原修复的影响 抗原修复的方法 高压加热法 微波修复法 酶消化法（常用胰蛋白酶和胃蛋白酶） Ki-67: 高压修复比较 Cytokeratin AE1: Trypsin 抗体的选择 常用的第一抗体一般为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，也有羊抗的抗体。 常用检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠、抗兔或抗羊免疫球蛋白，不能错配，否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。 最好选用既含抗鼠又含抗兔或抗羊免疫球蛋白的抗体。 酶标抗体系统中的酶与显色剂的合理选用 实验对照组的设置 实验对照目的: * 证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠。 * 染色操作是否正确。 * 避免试剂失效或操作失当而出现假阴 性和假阳性，确保染色结果的可靠性。 一、阳性对照 用已证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。 二、阴性对照 用确知不存在待检抗原的组织切片染色，结果为阴性。阴性对照可证实组织内若不含靶抗原就不应染色，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的“假阳性”结果。 1、空白对照 是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，