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实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质 N—末端和蛋白质的氨基酸组成分析 一、目的： 学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。 二、原理： DNS—Cl在碱性环境里蛋白质和肽的α-氨基酸的氨基起反应，生成带有荧光的、稳定的DNS-氨基酸（参看图19-1，19-2），其反应如下： 蛋白质在水解前与DNS—Cl反应，产生DNS-蛋白质，它标记在N-末端氨基酸残基上，经水解和薄层层析而测知是何种氨基酸。蛋白质水解后与DNS—Cl反应，标记的是蛋白质的氨基酸组成成分，如图19-1和图19-2所示。这是一种较为简便的、适用的蛋白质的氨基酸组成成分分析的方法。 DNS-蛋白质水解产物中包括下列DNS-衍生物：相当于N-末端的α-DNS-氨基酸，从链内赖氨酸及酪氨酸残基形成的ε-DNS-赖氨酸和O-DNS-酪氨酸，这些衍生物相当稳定。此外，DNS—Cl还与溶液中的氨起反应生成DNS—NH2，DNS-磺酰胺以及DNS—Cl水解生成的DNS—OH（DNS-磺酸）。 此法与氟二硝基苯法相比，有二个突出的优点，即水解产物无需提取，可用电泳或层析法直接鉴定氨基酸；另外就是灵敏度高，DNS-氨基酸的最大荧光激发值约为550nm，由于其荧光十分强烈，1—5n mol·L-1或0.2—1.0n mol·L-1 DNS-衍生物即可分别用电泳或薄层层析容易地检测。 DNS—Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物。其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可与DNS—Cl生成双DNS-氨基酸衍生物。这些氨基酸相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度达10—9—10—10摩尔水平。比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的氟二硝基苯（FDNB）法高100倍。 DNS-蛋白质（或肽），在5.7mol·L-1 HCl，110℃水解16—20h，DNS-蛋白质的肽键被打开。由于DNS基团与氨基之间的键结合牢固，绝大部分DNS-氨基酸都抗水解。除DNS-色氨酸全部被破坏；DNS-脯氨酸（77%），DNS-丝氨酸（35%），DNS-苏氨酸（30%），DNS-甘氨酸（18%），DNS-丙氨酸（7%）部分被破坏外，其余DNS-氨基酸很少破坏。 DNS—Cl与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，展层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。 DNS—Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即： 在DNS—Cl过量时，会产生DNS—NH2，即： DNS—OH在紫外光下产生蓝色荧光，DNS—NH2的位点往往和丙氨酸重合，在本实验条件下，需进行第三相展层。 根据鉴定方法需要，DNS—Cl的浓度5m mol·L-1（约每ml2.0mg丙酮溶液），保存在棕色瓶中，置避光处防止分解。样品浓度大约1m mol·L-1。反应液要求丙酮浓度50%，pH8.5—9.8，以保证游离氨基等功能团非质子化。在37℃保温，黄色消退即表示反应完全，一般约0.5h—1h。反应完后，混合物中含有较多DNS—OH，最好除去副产物后再水解DNS-蛋白质或肽。蒸干除去丙酮，加5.7mol·L-1 HCl，抽真空，封管在110℃水解20h，除去盐酸，加丙酮溶解点样展层，在紫外灯下鉴定荧光产物，同标准图谱比较，可区分未知DNS—氨基酸的种类。根据氨基酸的种类和数量可提供被测蛋白质或肽样品的纯度、肽链的数量和N-末端氨基酸的性质等方面的有价值的资料。 聚酰胺薄层层析鉴定DNS—氨基酸。展层后可鉴定所有的DNS—氨基酸。聚酰胺是一类锦纶的化学纤维原料（或称尼龙）。由己二酸与己二胺聚合而成的叫作锦纶66： 由己丙酰胺聚合而成的叫作锦纶6： 聚酰胺薄膜是将锦纶涂于涤纶片上制成，这类聚合物含有大量的酰胺基团，所以称为聚酰胺薄膜。 聚酰胺薄膜的酰胺基团可与被分离物质之间形成氢键，因此对极性物质有很强的吸附作用（图19-3）。被分离物质与酰胺基团形成氢键能力的强弱，确定了吸附能力的差异。在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键，选用适当的展层溶剂，使被分离的各种物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有较大差异经过吸附与解吸的展层过程，形成一个分离顺序，彼此分开。选择适当的溶剂系统在5×5cm大小的薄膜上双向层析，大部分氨基酸可有效地分开。 DNS-氨基酸的分离和鉴定： 1．溶剂系统 第Ⅰ相展层溶剂系统（1）：甲酸（88%）∶水=1.5∶100（V/V） 第Ⅱ相展层溶剂系统（2）：苯∶冰乙酸=9∶1（V/V） 第Ⅲ相展层溶剂系统（3）：乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸=20∶1∶1（V/V） 第Ⅳ相展层