绿色荧光蛋白教学课件.ppt

主讲人：靳阳涛 程龙 夏远洋 杜玉苹 李香菊;想要让我们的世界变得更加美丽吗？;一 基本介绍 二 绿色荧光蛋白发现与发展过程 三 绿色荧光蛋白的应用 四 应用前景;一 基本介绍什么是绿色荧光蛋白？;其基因所产生的蛋白质，在蓝色 波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光，称为绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP。 这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。 绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因;GFP结构;荧光蛋白发光的原理;不同属的水母体内荧光蛋白发光机制;荧光蛋白发光与萤火虫发光有什么联系吗?;根据科学家的研究，萤火虫的体内含有一种磷化物——发光质，发光质在体内如经发光酵素的作用，会引起一连串的生化反应，而萤火虫的光就是这些反应之后的副产品。萤火虫的光为冷光，不会让人有灼热的感觉。 生物学家发现，萤火虫尾部的白色排状部位就是它发光的位置，称作「发光器」。布满含磷的发光质及一种发光酵素。 ; 萤火虫有专门的发光细胞，在发光细胞中有两类化学物质： 一类被称作荧光素（在萤火虫中的称为萤火虫荧光素）。 另一类被称为荧光素酶。;叶绿素和绿色荧光蛋白的发光原理一样吗?; GFP性质;GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。 　 　由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。; 二;绿色荧光蛋白的发现——下村修 ;1974年，第一次获得GFP。;1992年，道格拉斯·普瑞金拿到了绿色荧光蛋白的基因;绿色荧光蛋白的推广——马丁-查尔菲 ;GFP第一次成为荧光指示剂;绿色荧光蛋白的改造——钱永健;　　除了让绿色荧光蛋白变得更加完美，钱永健等人还用它做模板，先后变出了蓝色系列、青色系列、黄色系列、橙色系列的荧光蛋白。???后来，一些科学家从一种海葵中分离出了红色，人们亲切地将其衍生出的红粉系列命名为草莓、樱桃、甜瓜、香蕉、橙子、梅子和覆盆子。至此，荧光蛋白终于能在细胞中画出一道完整的彩虹。; 在植物方面的应用; 分子标记;随着病毒在宿主体内不断扩散，你就可以通过跟踪发出的绿光来观察病毒的扩散途径，或者你把它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动;科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑神经细胞的发育过程。;在动物方面的应用;荧光老鼠;2007年韩国研究人员通过对母猫的皮肤细胞进行基因改造，用转荧光蛋白基因技术克隆出转基因荧光猫，在黑暗中发出红光，这标志着全球首次克隆出带红色荧光蛋白基因的猫，这项技术将有助于研究治疗人类遗传性疾病和发展干细胞研究和治疗。;荧光鱼宠物;绿色荧光蛋白兔子;绿色荧光猪;大脑彩虹图;四 应用前景;突变实验发现 , 多数突变导致 GFP 部分或完全丧失荧光活性 , 但某种突变使 GFP 明显地改变激发和释放波谱。 例如用 The 替代Ser 65 , 在 490 nm 处出现一个单一激发峰值 , 激发后产生的荧光强度是野生型的 6 倍 , 对光淬灭具有更强的抵抗性 , 并且出现红移现象 , 该突变蛋白质与 FITC 的性质相似 ; 同样 Leu 替代 Phe 64 , 即增加 GFP 的可溶性 , 荧光强度增强 35 倍。;3 个氨基酸同时突变时 , 在 360 nm 至 400 nm 之间 , 出现最大激发峰 , 而且增大生色团形成的机率 , 可溶性更强 , 荧光强度为野生型 GFP 的 18 倍。;现有人认为 , 低浓度 GC 含量是 GFP 低表达的原因之一 , 为此 , 研究人员合成了高 GC 含量的特殊 GFP , 并且发现这种 GFP 有更强的荧光强度 。 此外 , 用人蛋白质中偏爱的密码子替代相应的野生型 GFP 中密码子可提高 GFP 在哺乳动物中的表达效率。 许多 GFP 突变蛋白 , 不仅改变了激发和释放波谱 , 而且提高生色团形成的效率、溶解度、蛋白质表达等 ;不同的突变体给应用提供了更广阔的前景 , 但是也发现某些突变体在生理变化的 pH 值范围内显示了更大的敏感性。 研究人员利用一个 pH 敏感的 GFP 突变体检测细胞质、细胞核、高尔基体和线粒体基质中的 pH 值 , 发现在这些区域测量到的数值与以前报道的测量值有非常好的吻合 。;另外 ,GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白 , 作为基因治疗检测指标 。 但是 ,GFP 在应用中还发