外源性connexin43基因对大鼠骨骼肌卫星细胞表达connexin43蛋白的影响.pdfVIP

中文摘要 connexin43蛋白的影响 摘 要 目的 由于缺血坏死而导致心肌细胞的减少是急性心肌梗塞 及心脏衰竭的一个共同特征。对缺血性心肌损伤的治疗主要 集中于改善心肌的血供，减轻心肌缺血的症状，却不能使心 肌细胞再生，从而不能避免心衰的发生。因此，采用细胞移 植代替不可逆性心肌细胞的丢失有望成为受损心肌修复的 另一种有效途径。目前，用于心肌细胞替代治疗的移植细胞 种类较多，包括骨骼肌卫星细胞，胚胎性干细胞和成体于细 胞，胎儿心肌细胞等。骨骼肌卫星细胞所具有的易于获得、 用自体骨骼肌卫星细胞移植无需免疫抑制、细胞在培养阶段 易于接受外源基因、不受伦理限制等优点而成为心梗区细胞 移植研究的热点。移植细胞要发挥功能必须与周围正常心肌 细胞在解剖结构上发生整合以达到同步收缩。缝隙连接(gap iunction)，又称间隙连接、通讯连接，是由相邻两个细胞之间的 连接蛋白排列而成的一种特殊膜结构。相邻细胞通过缝隙连 intercellular junction 接所介导的细胞问通讯(gap 胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联，这对细胞 的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要 细胞之间的电信号传导有赖于缝隙连接蛋白结构和功能的 中文摘要 完整，因此连接蛋白表达对于实现同时收缩意义重大。目前， 有文献报道移植的原代骨骼肌卫星细胞因不能同宿主细胞 形成良好的电偶联而导致实验动物心率失常。本研究通过将 以 中的表达的情况，并从中选取connexin43蛋白表达高的细胞。 该细胞可用于进行移植细胞之间及移植细胞与宿主细胞之 间能否形成良好的电偶联的研究。 方法 DH．5Cl大肠杆菌中扩增，再提取、纯化及鉴定质粒。 肠杆菌DH．5Q菌株，用含氨苄青霉素的LB平板选择阳性菌 Plasmid 落。按天根小提质粒试剂盒和Wizard@Purefection DNAPurification System操作说明进行质粒的提取纯化，最 后进行酶切鉴定。 2大鼠L6骨骼肌卫星细胞培养 复苏大鼠M骨骼肌卫星细胞后，在37C，5％C02条件下， 当细胞达至U60％一70％融合时，即进行传代。 选浓度的确定 将大鼠L6骨骼肌卫星细胞以5×105的密度种植与6孔培 中文摘要 养板中，于完全培养基中分别加G418使其终浓度分别为 复孔，正常对照3复孔(即不加筛选抗生素)培养14天后观察 细胞死亡情况，选择高于杀死全部细胞药物浓度一个梯度的 浓度为筛选浓度。 4脂质体体外转染骨骼肌卫星细胞，确定最适转染条件及阳 性单克隆细胞的获得 试剂说明进行基因转染，确定最适转染比例。再将脂质体与 14天后挑取具有G418抗性的阳性单克隆细胞分别扩大培养 (以下称阳性单克隆细胞)。 5免疫细胞化学法和Western．blot法检测阳性单克隆细胞 中connexin43蛋白表达的结果 表达 取转染connexin43基因和转染空载体贴壁生长的细胞分 别爬片，用4％的多聚甲醛固定，行免疫细胞化学染色，检测 细胞中eonnexin43蛋白的表达情况，并由图象分析软件分别 计算出随机视野中阳性细胞的光密度值；统计方法选用单因 素方差分析法。 5．2 达 中丈摘要 提取细胞总蛋白，用考马斯亮蓝进行蛋白定量，制备不 连续SDS．聚丙烯酰胺凝胶(4％浓缩胶和10％分离胶)。取各 组变性胞浆蛋白上样于凝胶加样孔内，进行恒压电泳。用水 浴式电转移装置将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(NC 蛋白多克隆抗体，4C孵育过夜。加入HRP标记的羊抗兔IgG