讨论RIG1基因是自全反式维甲酸alltransretinoicacid合成.PDFVIP

第四章、討論 RIG1 基因是自全反式維甲酸（all trans retinoic acid）合成性維甲 類化合物 tazarotene 處理人類細胞時所分離出來的基因（DiSepio et al，1998；Huang et al，2000；Deucher et al， 2000），相關的研究發 現此基因具抑制癌細胞生長以及造成癌細胞凋亡（DiSepio et al， 1998；Deucher et al，2000； Huang et al，2002），此外，此基因之表 現與細胞之分化具正相關性（Duvic et al，2000；Shyu et al，2003）。 RIG1 基因屬於第二型腫瘤抑制基因家族之成員，此家族尚包括 H-rev107 （Husmann et al ，1998），與鼠類的同源基因 HRASLS （HRAS-like suppressor）（Akiyama et al，2001）。目前研究之結果顯 示，此家族成員之生物活性及功能可能與阻斷H-ras 訊息之傳遞有關 （Hajnal et al， 1994；Akiyama et al， 1999）。本實驗室亦於子宮頸 癌細胞株 HtTA 中發現，RIG1 融合蛋白之表現會抑制 ERK （extracellular signal- regulated kinase），JNK（Jun N-terminal kinase） 及p38 等MAPK（mitogen- activated protein kinase）激酶 的活性，這 些激酶 在細胞中的訊息傳導途徑皆位於 RAS 下游，這顯示 RIG1 可 能抑制Ras 腫瘤基因之訊息傳遞（Huang et al，2002），RIG1 基因對 癌細胞所造成凋亡及抑制生長的途徑，到目前為止尚未明朗確定，因 此本研究欲利用偵測細胞週期以及基因微陣列分析技術來探討 RI G1 28 基因所調控可能的訊息途徑，首先是利用西方墨點法確認製備之 pRIG1-myc 及 pRIG1-EGFP 質體能夠在 HtTA 子宮頸癌細胞中表現 RIG1 融合蛋白。我們發現，在細胞大量表現RIG1-EGFP 融合蛋白的 同時，細胞呈現凋亡型態的數量比對照組多，表現 RIG1-EGFP 融合 蛋白的細胞型態呈現圓形或者隆起且細胞核皺縮的狀態；有類似於細 胞凋亡之型態出現，而對照組則是沒有改變，這跟之前實驗室所發現 到的情形是相同的（Huang et al，2002）。 在偵測細胞週期部分，HtTA 細胞及MCF-7 細胞表現RIG1-myc 融合蛋白 24、30 及 40 小時後，利用流式細胞儀分析之結果顯示 RIG1-myc 融合蛋白之表現沒有影響細胞週期各相位之分佈，這與預 期融合蛋白可能影響到細胞週期的進展（progression）而造成細胞凋 亡或生長遲滯的結果有出入，也許在偵測細胞週期時選定時間點不恰 當，或者細胞在大量表現融合蛋白的早期，已經趨向凋亡的途徑了， 本研究中在偵測細胞週期時並沒有同時偵測細胞凋亡的比例，而無法 實際的量化出 RIG1 蛋白造成凋亡的程度，未來研究將細胞轉染 pRIG1-EGFP 質體，然後用DNA 染劑PI 及細胞凋亡染劑Annexin 染色，利用流式細胞儀區隔出有表現 RIG1-EGFP 螢光蛋白（FL-1） 的細胞，然後偵測PI（FL-3）及Annexin （FL-2）螢光表現的情形， 就可以量化出細胞凋亡的比例。 29 在基因微陣列分析系統方面，HtTA細胞在轉染pRIG1-myc質體24 小時後，轉染效率85％，待測樣本與晶片雜交後經電腦掃描偵測到共 有294個基因的表現上升，沒有表現下降的基因，這些基因可歸類為 有關細胞凋亡、細胞週期、細胞複製、DNA受損、DNA修補、發炎 反應、細胞新陳代謝及輸送離子養分等8個主要類別。在被調控表現 增加跟細胞週期有關的群組中，對於細胞週期關卡（cell