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(10)过氧化物酶显色反应：以DAB H2O2液显色7～10min(镜下控制显色程度)，PBS洗，5min×3； (11)碱性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX及坚固蓝(fast blue)显色10～15min(镜下控制显色程度)，PBS洗、自来水洗； (12)缓冲甘油封片，光镜下观察 注：若为同种动物抗血清，可分别进行标记染色，其间应经多聚甲醛蒸气处理4h或用pH2.2的甘氨酸---盐酸溶液处理2h，以避免彼此的交叉反应。 P P P A A A κ λ 图2 双酶双底物(复合物法)双重酶标染色原理 兔PAP GAR IgG 兔抗K Ag 鼠APAAP GAM. IgG 鼠抗人 ★其它双重标记法 1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用(先酶标 后荧光) 2.免疫荧光法与免疫金银法联合应用(先 免疫金银标记后荧光标记) * 免疫组织化学的 双重或多重标记 要 求： 1.掌握IHC多重标记染色的基本原理 和技术要求 2.了解常用方法类型及其优缺点 概 述 应用IHC的方法在同一张组织切片上同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，即谓双重或多重免疫标记。 显示的水平可以是光镜，也可以是电镜 常用方法类型有： 按标记物分：免疫荧光双重标记(FITC-TRITC)，免疫酶双重标记(单酶双底物-HRP:DAB与4CN/ H2O2);AP:萘酚AS-MX/坚固红与坚固蓝；双酶双底物(HRP与AP，DAB /H2O2与萘酚AS-MX /坚固红)；免疫胶体金标记(5nm与15nm)。 按标记抗体分：直接、间接法、复合物法等 按抗体制备动物来源分：异种动物抗体法与同种动物抗体法。 按有否洗脱去除第一重抗原抗体复合物分：洗脱法与非洗脱法。 一般多采用荧光或酶标间接法，混合试剂，不洗脱，光镜以双荧光或双底物酶标记为多，颜色区别。电镜以胶体金不同直径颗粒(5nm与15nm)标记为多，颗粒大小区别。 一、基本原理 双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位标记两种或两种以上抗原抗体复合物， 达到在同一细胞或亚细胞水平显示不同抗原成分(定性、定位、定量)，分析不同抗原成分相互间的功能关系，操作遵循的原则与要求同单标免疫组化方法。 为了避免前重免疫标记与后重标记的交叉、重叠，其间可采用酸洗破坏(洗脱法)或饱和封闭(非洗脱法)加以克服。 二、光镜下的多重免疫标记染色 （一）双重免疫荧光标记染色 采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。 常用的荧光素配伍主要为：异硫氰酸荧光素(FITC)呈绿色与罗丹明(RB200)或异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）呈红色。 技术方法敏感、特异，需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样本不能长期保存。 技术类型：有直接法和间接法之分。前者特异、快速，后者敏感、多用。 所用抗体试剂可为异种动物抗体，也可为同种动物抗体。 异种动物抗体常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低。 同种动物抗体多分别应用，操作步骤加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理。 操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH双重免疫荧光标记染色（间接法） (1)石蜡切片，厚5μ m，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4, 0.01mol/L)。 (2)1％人血清白蛋白（HAS）孵育10min （亦可用10％正常羊血清代之），不洗。 (3)抗ACTH血清（McAb）1:200，孵育 30min 37℃，湿盒。 (4)0.05mol/L TBS(pH7.4,内含1％ Triten× 100,下同)洗，10min×3。 (5)羊抗鼠IgG-TRITC 1:100，湿盒，室温避光反应1h。 (6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，10min×3，(第一重ACTH-TRITC标记染色已完成)。 (7)切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在80