斑点杂交测乙肝病毒核酸〖精品课件〗方案介绍.pptVIP

myszjpwd-myxr-xm 斑点杂交测乙肝病毒核酸 引言 许多乙肝患者正遭受着慢性疾病的折磨,他们可能未曾意识到乙肝病毒还会传染给家人。一方面,实现乙肝疫苗预防接种可大大减少乙肝病毒的感染,另一方面只有通过早诊断、早治疗才能减少乙肝病毒载量,从而降低乙肝病毒的数量。这样不仅保护了患者的自身,还保护了他的家人。 乙肝病毒DNA就是指脱氧核糖核酸,世界上任何生物都是依靠自身的DNA来复制后代的,乙肝病毒也是一样。HBV DNA侵犯人的肝细胞后,控制从复制、装备到释放病毒的全过程,HBV DNA阳性说明体内有活性病毒的复制。HBV DNA高复制就意味病情的稳定性可能比较差,传染性比较高。对HBV DNA的检测同时又有一个监测的意义。对HBV DNA的检测一般有两种, (2) 预杂交液:5×SSC,0.5﹪(w/v)封阻 试剂,1﹪(w/v)N-十二烷酰基氨酸 钠,0.02(w/v)SDS; (3) 杂交液:在预杂交液中加入探针,浓度 为2ng/μl; (4) BufferⅠ:100mM Tris-HCl; 150Mm NaCl; pH7.5(20℃) (5) BufferⅡ:0.5﹪(w/v)封阻试剂 配于BufferⅠ中 (6)BufferⅢ:100mM Tris-HCl; 100mM NaCl; 50mM MgCl2; PH9.5(20℃) . 3 2×SSC ;1×SSC ;0.5×SSC 4 抗体 5 显色液 6 显色底物液 7 硝酸纤维素膜 8 微量加样器,培养皿,吸管,烤箱等 三实验方法 1、处理:将硝酸纤维素膜与20xSSC中浸泡1h,夹在两层滤纸中烘烤20～30min 2、变性:将待测DNA样品与100℃水浴10min,立即置冰水中。(使DNA样品变性,即双链DNA→单链DNA) 3、点样:将上述变性后的样品各2～4μl点在硝酸纤维素膜面上,室温下风干后,于烤箱80℃烘烤1～2h(使样品中DNA的与膜结合牢固) 4、预杂交:将点样固定的杂交膜置于预杂交液中,60℃水浴摇床轻轻振摇30min～60min。(封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点) 5、杂交液制备:用预杂交液将探针按2ng/μl浓度稀释,即为杂交液,100℃水浴5min变性。 6、杂交:将杂交膜封入杂交袋中,加入杂交液2～3ml,除去气泡,封口。置于60℃恒温摇床上,轻轻振荡过。 7、洗膜:(洗去未结合的探针,否则会导致过高的本底) (1)回收杂交液 (2)室温下,依次用2xSSC,1xSSC,0.5xSSC洗膜两次,每次5min 8、封闭:取出膜,在含有3～5ml BufferⅠ的培养皿中浸泡10min平衡后,转入3～5ml BufferⅡ中,37℃作用30min。(封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点) 9、酶联抗体结合:将杂交膜封入一个新的平皿中,加入2～3ml抗体(抗体稀释方法:加1μl Anti-DIG-AP到3ml BufferⅡ后轻轻摇匀 4℃可保存12h。),室温作用30min,经常摇 动,使酶联抗体与地高辛结合。 10、洗膜(洗去未结合的酶联抗体) (1)取出膜,将膜放入含有3～5ml BufferⅠ的培养皿中,洗膜两次,每次10～15min。 (2)取出膜,将膜放入含有3～5ml BufferⅢ的培养皿平衡2～5min。 11、显色:(1)将45μl NBT solution和35μl X-Phosphate加入到10ml BufferⅢ中,显色液必须现配现用!(2)在10ml新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时,常在12h内完成反应。 四 实验结果 标本1(浓度低显色慢且浅)和标本2(浓度高显色快且颜色深)显色,标本3与阴性对照不显色,说明标本1和标本2为乙肝病毒阳性,标本3为阴性.