17细胞因子测定及应用.pptVIP

细胞因子的免疫学检测 分泌型细胞因子的检测 细胞内细胞因子的检测 敏感性偏低 不能判断细胞因子的生物学活性。 ELISA 特异、简便 易于推广和标准化等优点 可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理 细胞因子测定的首选方法 ELISPOT 酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot) 在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。 一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关 基 本 原 理 细胞内细胞因子检测技术 激活 膜抗原标记 细胞内细胞因子标记 流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。 1．分离和培养待检细胞 2．细胞固定 3．封闭非特异性结合位点 4．染色与分析 基本步骤 使用流式细胞分析法，可以： 区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1细胞 IFN-γ Th2细胞 IL-4 细胞表面的粘附分子或细胞因子受体： 单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态 四、免疫学测定方法学评价 优点： 特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。 缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合 细胞因子的分子生物学检测 此方法测定的并非细胞因子本身，而是细胞因子的基因。 方法： 1、Northern印迹杂交法 2、Southern 印迹杂交法 3、PCR与逆转录PCR 4、原位杂交，原位PCR和原位RT—PCR  第三节 常用细胞因子的检测方法 一、IL-2的检测 二、IFN-γ的检测 三、TNF的检测 待检样品（细胞上清） 指示细胞（CTLL-2） 按不同稀释度加入 37oC，16-20小时 加入3HTdR（1-5?Ci） 37oC，4-6小时 收集细胞 测定 白细胞介素-2的测定示意图 待检样品（细胞上清） 指示细胞（L929） 按不同稀释度加入 37oC，4小时 37oC，24-48小时 弃取上清，加入VSV 观察细胞病变（镜检或比色） 干扰素的测定示意图 肿瘤坏死因子的测定示意图 待检样品（细胞上清） 指示细胞（L929） 按不同稀释度加入 37oC，24小时 弃取上清，洗涤 加入结晶紫染液，洗涤 加入细胞裂解液，比色 第四节 细胞因子受体的检测 一、细胞因子受体的类型 二、细胞因子受体的检测 细胞因子受体的类型 膜型细胞因子受体 分泌型细胞因子受体 细胞因子受体的检测方法 膜型细胞因子受体的检测 配体检测法 抗体检测法 分泌型细胞因子受体的检测 标记抗体检测法 本章小结 1、细胞因子的作用特点与检测特点 2、细胞因子检测的原理与方法 3、常用的细胞因子检测 4、细胞因子受体的检测 * 第一节 细胞因子检测概述 一、细胞因子的类型与作用特点 二、细胞因子检测的特点与方法 由非神经—内分泌细胞产生的一大类与免疫应答活动密切相关的低分子蛋白与多肽。 细胞因子 细胞因子的类型与作用特点 1、细胞因子的分类 2、细胞因子的作用特点 以生物学作用进行划分的分类 白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN-?、IFN-?、IFN-? 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- ?、 TNF- ? 集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF- ? 趋化因子（Chemokine）—— IL-8、GROs、MCP-1 生长因子（Growth factor）—— EGF