预览-凯基生物.PDFVIP

免疫学实验常见QA Western Blot 常见问题及处理(一) 1、western blot 的优点 答：灵敏，可达ng 级，用Ecl 显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？ 答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋 白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白， 多看看说明，看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样 品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 4 、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB ？ 答：可以选择0.2 μml 的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱，怎么加强？ 答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏，有什么解决方法？ 答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？ 答：你的一抗浓度较高，二抗 HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临 界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓 度降低，或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM 底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL 底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。 9、我在显影液中显影1 分钟和5 分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢? 答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是 否有改善.；b) 显影时间过长。 10、DAB 好还是ECM 好？ 答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM 结果容易控制，但被 催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验 的情况。 11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？ 答：a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。 b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等 12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？ 答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够，。 13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF 等？ 答：NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候 是不用加的。 14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot 试验吗？ 做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不 易与背景区分；Western blot 可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。 ②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实 验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。 15、做Western Blot 时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一 抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 μg，换了个santa cloz 的一抗仍 不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF 行吗？ 答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。 同时，建议检查Western Blot 过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 16、细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？ 答：一般5 ×10^6 就足够了 17、同一样品能同时提RNA 又提蛋白么？这样对western blot 有无影响？ 答：能，没有问题。 18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot 检测吗？ 答：当然可以，有