基因座控制区元件HS2、HS3对β珠蛋白基因表达调控的研究.pdfVIP

上海第二医科大学博士论文 基因座控制区元件HS2、HS3对人13一珠蛋白基因表达调控的研究 中文详细摘要 珠蛋白基因的表达具红系组织及发育阶段特异性，这种特性使其成为研究真 核基因表达调控的极好材料。位点控制区(Locus 控珠蛋白基因表达的组织特异性及发育阶段特异性的重要顺式元件之一。Hs：、 因的时空表达调控，对了解B一珠蛋白基因表达的转换机制及p一地中海贫血的基因 治疗具有重要价值。 一表达载体的构建 为构建高效的红系特异表达载体，首先，以人基因组DNA为模板，利用 长4．2Kb，包括1．7 Kb的启动子、3个外显子、2个内含子及1．1Kb的3’端非编 动下以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的红系特异表达载体，它们分别是BP、 二细胞水平研究 为了研究这些载体在细胞水平上的表达情况，我们选择了两种红系细胞系 上海Jg_-医科大学博士论文 胎儿期的人红白血病细胞系，主要表达胚胎及胎儿期的￡、7-珠蛋白及部分、0l一 珠蛋白；而MEL是接近成年期的小鼠红白血病细胞系，可表达B一珠蛋白。 为了观察处于胚胎／胎儿期的K562细胞中，是否有B一珠蛋白基因的转录或 表达，以及其转录或表达水平是否受氯化高铁血红素(Hm)诱导的影响，我们通 48及72小时后，不仅其v一珠蛋A 明显增加，且这种诱导作用在诱导24、48小时后比较明显；Hm还可增加重组 可能与vjB一珠蛋白基因转换机制相关。 子驱动下的EGFP表达调控，我们用脂质体介导转染法将～系列表达载体转染到 镜下观察荧光表达情况。结果显示：在13．珠蛋白启动子前加上HS2元件后，表 达EGFP的K562细胞所占比例由原来的O．38％增加到l2％；MEL细胞由5．7％ 珠蛋白启动子的调控功能；而在MEL细胞中HS3可增强13．珠蛋白启动子的调 细胞中均无明显协同作用。 三个体水平的研究 2 上海第二医科大学博士论文 HS3／GFP，并用显微注射技术获得了相应的转基因小鼠，平均整合率为10．89％。 为了研究各构建载体在转基因小鼠组织中的表达情况，选择年龄、体重相当 的转基因小鼠，用流式细胞仪分析血液、肝脏、骨髓、脾脏、肺、肾脏、心脏、 基因小鼠中，EGFP在各红系组织，如骨髓、脾脏、外周血中均有表达，尤其以骨 髓中表达量最高；而在肝脏、肺、肾脏、脑等非红系组织中，没有检测到EGFP 的表达。表明HS2元件及1．7kb的D．珠蛋白启动子足以调控p一珠蛋白基因的组织 特异性表达。 为研究不同重组载体的表达情况，经流式细胞仪分析及荧光显微镜下观察各 相应的转基因小鼠外周血中EGFP表达情况，结果如下：两只CMV／GFP小鼠中， 6％、O．6％、 8只CMV／HS2／GFP小鼠中，表达EGFP的阳性细胞数平均为1．46％(2 O．4％、1．5％、O．6％、O．4％、4 的阳性细胞数平均为1．91％(2 明：在转基因小鼠中，GFP的表达虽有明显的个体差异，但综合分析比较可以看 出，HS2与HS3元件在调控B一珠蛋白基因表达方面，其增强子作用基本相当， 且二者显示出显著的协同作用。 小鼠中的时空表达情况，我们选择年龄、体重相当的阳性转基因公鼠，分别与年 天、18-18．5天时，解剖母鼠，取出胚胎或胎鼠在荧光显微镜下观察各组织EGFP 表达情况。实验结果显示： 的表达，直到胚胎发育到10．5天时，其血液中有少量细胞表达EGFP，而在包围 胚胎的卵黄囊上有大量细胞表达EGFP。在胚胎发育到13．5天时，有大量肝脏组 织细胞表达EGFP，其包围胚胎的胎膜上(有卵黄囊成分)仍有大量细胞表达 上海第=医科大学博士论文 脏组织细胞中也有EGFP的表达。由此看出，在HS2元件的调控下，p一珠蛋白启 动子可以驱动EGFP在胚胎期的卵