基因工程菌Pseudomonas spB31的构建及其产邻苯二酚发酵条件的优化.pdfVIP

基因工程菌Pseudomonas sp．B3．1的构建 及其产邻苯二酚发酵条件的优化 摘要 邻苯二酚，又名儿茶酚，是一种重要的精细化工原料，主要用于生产 抗氧化剂、鞣剂、香料、染料、感光材料及橡胶等，也在农药生产和医药 合成方面有应用广泛。目前应用化学合成法和直接萃取法生产邻苯二酚效 益都不高。但近年来由于国内需求量急剧的增加和清洁可持续生产的需要， 人们不得不研究经济有效的生产工艺，其中生物法合成邻苯二酚就是研究 热点之一。 本文主要利用实验室保存的一株能够降解苯甲酸钠生产邻苯二酚的野 生菌株Pseudomonas sp．B．1来构建高产邻苯二酚的基因工程菌，并对工程菌 产邻苯二酚的发酵条件进行了初步优化等方面的研究。 根据Genbank已报道的Pseudomonasstr．L48苯甲酸双加氧 entomophila Pseudomonas sp．B．1的基因组DNA中克隆到合成邻苯二酚的基因簇 为环羟化酶的a亚基和p亚基，PSB．C编码的蛋白质为电子传递组分，环 羟化酶和电子传递组分共同作用，将苯甲酸钠双加氧还原为非芳香簇顺式 二醇或顺．1，2．二羟基苯甲酸。PSB-D编码的蛋白质为短链脱氢酶，能将顺 I ．1，2．二羟基苯甲酸进一步脱氢脱还原成邻苯二酚。因此，利用PSB-AC移 PSB-AD两段序列进行基因工程菌的构建。 将PSB-AC、PSB-AD分别与载体pKl 构建了6个广宿主重组质粒转入E．coli 够B．1为受体菌，在含有pRK2073质粒菌株的帮助下，进行六组三亲本杂 交实验，筛选到的接合子通过抗性筛选、PCR以及Southern杂交的验证， 获得一株邻苯二酚产量提高的基因工程菌，命名为Pseudomonas sp．B3．1。 经过比较不同生长时期工程菌与原始菌发酵液中邻苯二酚的产量发现，工 程菌的邻苯二酚产量有一定的提高，36小时左右邻苯二酚产量最高为O．5 mg／ml，比原始菌的产量提高了10％。 最后对基因工程菌产生邻苯二酚的发酵条件进行了单因素和正交优 化。结果表明，当苯甲酸钠浓度为6．0 g／L，聚蛋白胨浓度为2．0g／L，温度 为32℃以及pH值为6．0时，工程菌在200rpm旋转摇床发酵36小时后， 邻苯二酚产量达到0．7 mg／ml，比优化前提高了20％。 关键词：邻糊苯喇假单胞菌苯啊蚴昨嘴基因簇基因磁 Ⅱ oF CONSTRUCTIONENGINEERINGSTRAIN 脚移DD肋移!?、j14SS只B3．1ANDOPTIMIZATIONoFITS FERMENTATIoNCONDITIoNSFORCATECHoL ABSTRACT an chemicalintermediateforthe Catechol(1，2一benzenedi01)isimportant of synthesis and to lower ofcatecholfrom pesticidemedicine，etc．Upnow，The yield and fast extractedfromthenatural cannotmeetthe chemosynthesis