大肠杆菌EHEC O157：H7突变株的构建和新预测TTSS分子伴侣基因的克隆表达.pdfVIP

摘 要 肠出血性大肠杆菌0157：1-17是引起人腹泻，出血性结肠炎以及溶血性尿毒 综合症的病原菌，它主要通过TlrSS将毒力因子分泌到宿主细胞中致病。目前在 了很多，而且目前鉴定的5个效应蛋白作用也无法解释EHEC0157：1-17所导致 的复杂的病理反应。为了深入研究EHEC0157：H7的致病机理，我们首先从所 有病原菌基因数据库中提取有关ITSS序列数据，同时进行摸体分析、同源分析 以及基因定位分析，预测出4个EHEC0157：1-t7可能的新分子伴侣，我们拟对 EHEC 0157：H7中预测的4个新分子伴侣进行类别鉴定，并进一步开展新分子伴 侣的结构与功能方面的研究。 7,Red体内重组技术是近年来发展起来的一种基于同源重组原理在细菌染色 体上直接修饰各类DNA分子的新技术，可以在原核生物中实现精确、快速的基 因敲除和敲入，较之传统的酶切、连接、转化的方案更快速方便，而且应用范围 更广泛，是基因工程技术的重要补充。 本论文利用了),Red体内重组技术，其主要技术路线是利用设计引物通过 PCR的方法合成外源线形DNA，该引物由40。至50-nt的被敲除基因的同源区以 及20nt的含FRT位点的质粒抗性基因同源区组成。将合成的外源DNA电转化 0157：H7中，这样 至已经获得了pKD46并且经过阿拉伯糖诱导的宿主菌EHEC 0157：H7染色体上的分子 外源DNA片段就会在pKD46的作用下，替代EHEC 伴侣基因。最后通过FLP位点特异性重组酶将外源线形DNA分子上抗性基因去 除。利用该方法成功的敲除了新预测的4个分子伴侣基因中的2个，并通过PCR 鉴定，DNA测序证实了实现了精确敲除。 在通过利用7．Red体内重组技术将分子伴侣进行基因敲除，构建了相应的 EHEC 0157：1-17缺失突变体以后，我们将野生型EHEC 0157：I-17和2个缺失突交 体进行培养，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测它们的胞外分泌蛋白的差异， 找到了不同的差异蛋白，对差异蛋白进行了初步分析。 与此同时，我们还将预测的2个新分子伴侣基因进行了克隆，构建到表达载 体上，成功的进行了表达· 这些实验工作为以后寻找新的相应的效应蛋白以及它们在宿主细胞中的可 能作用途径，并最终阐明和揭示EHEC0157：H7的致病机理奠定了基础。 内同源重组；基因敲除：蛋白图谱；克隆表达 Ⅱ Abstract E anenteric associatedwith Enterohaemorrhagiccoli(EHEC)ispathogen with diarrhea colitisandless thrombotic haemorrhagic com埘旧nly thrombocytopenic the and ureminc CaUSeSpathogenesis purpurahaemolyticsyndrome[1，2】．mainly,it bacterial the cell． TTSS virulent intohost through diversing proteins by maineffecter inEHEC0157：H7have At